АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОСОРБЕНТОВ НА ОСНОВЕ СЕФАРОЗЫ

Антиген ковалентно привязывают к нерастворимому носите­лю, обычно к сефарозе 4В или 6В (Ахёп е! а1., 1967; Сиа1гесаза5. АпПпзеп, 1971), и конъюгатом антиген-сефароза заполняют хро­матографическую колонку.

Этот метод позволяет довольно быстро получать хороший вы­ход специфических антител к белковым антигенам, таким, как ге­моцианин или бычий сывороточный альбумин, к конъюгатам бе- лок-гаптен, к гликопротеидам и к полисахаридным антигенам (см. разд. VI,Б). При этом можно раздельно выделять из одной п той же сыворотки антитела, обладающие разной аффинностью к антигену.

Так как прямое связывание высокомолекулярных полисаха­ридных антигенов с активированной СЫВг сефарозой 4В невоз­можно, предварительно получают конъюгаты полисахаридов с белком, которые затем присоединяют к активированной сефарозе обычным методом через белок (Ахёп е1 а!., 1967).

А. Получение комплекса белок — пневмококковый полисахарид

типа III

Метод конъюгации, в первоначальной своей форме описанный Гебелем и Эвери (ОоеЬе1, Ауегу, 1931), применим для любых по­лисахаридов. Вначале получают л-нитробензиловый эфир поли­сахарида, восстанавливают его в л-аминопроизводное, затем пе­реводят в диазониевую соль, которую потом соединяют через диазогруппу с любым белком, содержащим остатки ароматичес­ких аминокислот (Ртсиз е1 а1., 1970; ^1оп е1 а1., 1970). В 100 мл воды растворяют 250 мг 5111, доводят рН до 11 разведенным ИаОН, помещают в водяную баню при 100°С и пятью порциями добавляют 1 г л-нитробензилбромида. Смесь перемешивают до полного растворения кристаллов нитробензилбромида (около

2 ч), поддерживая рН между 10 и 11 добавлением 5 н.

0, 25 н. НС1, и на ледяной бане, энергично перемешивая, медленно (в течение 20 мин) добавляют к нему небольшой избыток 0,5 М нитрита натрия. Затем раствор соли диазония быстро вливают в раствор 500 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 50 мл 0,2 М боратного буфера с рН9. Раствор хорошо перемеши­вают, поддерживая рН между 10 и 11 с помощью разведенного МаОН. Смесь оставляют при 0°С и рН 10 на 4 ч, а затем получен­ный темно-оранжевый раствор конъюгата 5111-азо-БСА диализу­ют против воды и после удаления центрифугированием неболь­шого осадка лиофилизируют. Конъюгат содержит по весу около 30% полисахарида.

Б. Присоединение конъюгата ЗШ-азо-БСА

к активированной СМ*г сефарозе 4В

Метод активации сефарозы 4В описан в ряде работ (Ахёп е4 а1., 1967; Сиа^есазаз, АпПпзеп, 1971) (готовый препарат сефаро­зы 4В, активированной СЫВг, поставляет фирма РЬагшас1а, Уп- сала, Швеция). Лиофилизированную сефарозу 4В, активирован­ную СЫВг (15 г), регидратируют в 0,001 М НС1 и промывают примерно двумя литрами этого же раствора на пористом стек­лянном фильтре. К промытому осадку сефарозы добавляют 130 мг конъюгата, растворенного в 100 мл 0,1 М ЫаНСОз с рН8,3, содержащего 0,5 М ИаС1, и осторожно перемешивают 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Несвязав- шийся белок отмывают тем же буфером на пористом стеклянном фильтре, избыток активных групп блокируют 1 М этаноламином (рН доводят до 8,5 с помощью НС1) при комнатной температуре в течение 2 ч.

Номера фракций Рис. 4. Фракционирование антител сыворотки 3968 на иммуносорбенте аити- геи — сефароза. Объем фракций — 3,5 мл; поглощение измеряли при 280 нм. Кривая с крести­ками — градиент рН; О — начало градиента. (Подробности в тексте.)

Рнс. 5. Изоэлектрофокусирование фракций антител, полученных из сыворот­ки 3968 (см. рис. 4).

А — сыворотка 3968 до фракционирования; В — фракция 2; С — фракция 3;

О — фракция 4; Е — смесь равных количеств фракций 2 и 4.

1. Адсорбция специфических антител и элюция их

с иммуносорбента

Максимальную емкость нммуносорбента определяют в опытах насыщения, добавляя к одному и тому же его количеству возрас­тающие объемы антисыворотки. Определив оптимальное соотно­шение антиген — антитело, проводят эксперимент в большом объеме. Пример типичного опыта: на колонку (1,5X30 см), за­полненную иммуносорбентом (50 мл), нанесли 12 мл антисыво­ротки № 3968 к пневмококку 5111, содержащей смесь антител; иммуносорбент промывали ЗФР до тех пор, пока оптическая плотность при 280 нм не стала меньше 0,05; при этом адсорбция была сочтена полной, так как в буфере, выходившем из колонки, не обнаруживались антитела.

1 единицу рН), фракции 2 и 4 были очень сходны, но не идентич­ны, что четко видно при ИЭФ их смеси (рис. 5, гель Е). Эти фрак­ции очень сильно отличаются от фракции 3. Методом количест­венной преципитации было показано, что общий выход антител в фракциях составляет 68% от общего содержания их в сыворот­ке. Так же, как и при электрофорезе в агарозном блоке, ни одна из фракций не бывает здесь абсолютно чистой. Рециклическая аффинная хроматография отобранных фракций часто позволяет получить гомогенные антитела, которые в ИЭФ не отличаются от типичных миеломных белков.

2. Другие методы элюции[12]

Хороший выход антител можно получить, используя ступен­чатую или градиентную элюцию 0,1 М НСЬглициновым буфером с рН2,5, ЗМ тиоцианатом аммония (БапсШкег е1 а1., 1967) или

2 М Ыа! (Аугашеаз, Тегпупск, 1967).

В. Выделение специфических антиаллотипических антител

Метод аффинной хроматографии можно также использовать для выделения специфических кроличьих антиаллотипических антител. Иммуноглобулины или гомогенные антитела с известной аллотипической специфичностью присоединяют к сефарозе 4В, а элюцию проводят 4М гуанидином на 0,05 М глициновом буфере с рН 3,5 (Ааз1ес1 е! а1., 1967) или 0,2 М уксусной кислотой (Ла1оп е* а1, 1976).

Г. Выделение специфических антиидиотипических антител

Кроличьи антитела к идиотипам можно выделить из соответ­ствующей антисыворотки (9 мл) аффинной хроматографией на сефарозе 4В (40 мл), к которой ковалентно привязаны антитела данного идиотипа (20 мг).

2,4 мг специфических антиидиотипических антител. (Зо^п е! а1., 1976).

Д. Выделение антител к гаптенам

Антитела к ДНФ (ОНапйег, ЫШе, 1975) и к фосфорилхолину, (СЬезеЬго, МеЬ^ег, 1972) можно выделить таким же образом, используя производные соответствующих гаптенов, прямо свя­занные с сефарозой 4В. Элюцию проводят растворами гаптенов (ОоеЫ, Ме1г^ег, 1970), избыток лиганда удаляют либо диали­зом против нейтральных буферов, либо — в случае заряженных гаптенов (ЫШе, Е1веп, 1966) — хроматографией на ионообмен- нике.

Если антитела обладают высокой аффинностью к данному гаптену, то для их выделения используют комплекс сефарозы с другим, перекрестно-реагирующим гаптеном, обладающим мень­шей аффинностью к данным антителам, и его же используют для элюции антител с сорбента. Избыток гаптена удаляют диализом, а гаптен, связанный с антителами, можно удалить денатурацией в 6М гуанидин-НС1 при температуре 4°С. Белок затем ренатури- руют диализом против растворов с убывающими концентрациями гуанидина-НС1, а потом проводят диализ против ЗФР. Выход ан­тител при денатурации — ренатурации в случае антител к диги- токсину колеблется в пределах от 73 до 94% (Сиге! е! а!., 1971).

Е. Регенерация иммуносорбентов

Для удаления всех антител иммуносорбент отмывают 0,2 н. СНзСООН, 0,1 М НС1-глициновым буфером или ЗМ тиоцианатом, затем снова уравновешивают ЗФР, содержащим 0,02% ИаЫз, и хранят при 4°С.

Ж. Общие соображения об очистке класс-специфических иммуноглобулинов

Следует подчеркнуть, что большинство препаратов иммуно­глобулина определенного класса обычно содержит примеси 1§ других классов, за исключением 1§0, выделенных хроматогра­фией на ДЭАЭ-целлюлозе, и 1§М, выходящих в первом пике при хроматографии на сефадексе 0-200.

гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию. Примесь Н-цепей (а, ц,) или Ь-цепей можно удалить аффинной хромато­графией с соответствующими сыворотками анти-а, анти-ц или анти-Ь (\\/Пс1е, КозЫапй, 1973).

VII.