Глава 1 ХИМИЯ БЕЛКОВ

Мир самого сложного—жизнь.

Н.Н. Семенов

Живой организм характеризуется высшей степенью упорядоченности составляющих его ингредиентов и уникальной структурной организацией, обеспечивающей как его фенотипические признаки, так и многообразие биологических функций.

Белки—это высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот. Название «протеины» (от греч. рго1о§—первый, важнейший), по-видимому, более точно отражает первостепенное биологическое значение этого класса веществ. Принятые в отечественной литературе термины «белки» и «белковые вещества» связаны с обнаружением в тканях животных и растений веществ, имеющих сходство с белком куриного яйца. В наше время, когда абсолютно достоверно установлено, что наследственная информация сосредоточена в молекуле ДНК клеток любых живых организмов, не вызывает сомнения, что только белки являются теми молекулярными инструментами, при помощи которых реализуется генетическая информация. Без белков, в частности ферментов, ДНК не может реплицироваться, не может самовоспро- изводиться, т.е. лишена способности передавать генетическую информацию.

Живая природа характеризуется рядом свойств, отличающих ее от неживой природы, и почти все эти свойства связаны с белками. Прежде всего для живых организмов характерны широкое разнообразие белковых структур и их высокая упорядоченность; последняя существует во времени и пространстве. Удивительная способность живых организмов к воспроизведению себе подобных также связана с белками. Сократимость, движение — непременные атрибуты живых систем—имеют прямое отношение к белковым структурам мышечного аппарата. Наконец, жизнь немыслима без обмена веществ, постоянного обновления составных частей живого орга-низма, т.е.

Таким образом, белки (белковые вещества) составляют основу и структуры, и функции живых организмов. По образному выражению одного из основоположников молекулярной биологии Ф. Крика, белки важны прежде всего потому, что они могут выполнять самые разнообразные функции, причем с необыкновенной легкостью и изяществом. Подсчитано, что в природе примерно 1010—1012 различных белков, обеспечивающих существование около 106 видов живых организмов различной сложности орга-низации начиная от вирусов и кончая человеком. Из этого огромного количества природных белков известны точное строение и структура ничтожно малой части (см. далее). Каждый организм характеризуется уникальным набором белков. Фенотипические признаки и многообразие функций обусловлены специфичностью объединения этих белков, во многих случаях в виде над- и мультимолекулярных структур, в свою очередь определяющих ультраструктуру клеток и их органелл.

В клетке Е.соН содержится около 3000 различных белков, а в организме человека насчитывается более 100000 разнообразных белков. Самое удивительное, что все природные белки состоят из небольшого числа сравнительно простых структурных блоков, представленных мономерными молекулами —аминокислотами, связанными друг с другом в полипептидные цепи. Природные белки построены из 20 различных аминокислот. Эти аминокислоты могут объединяться в самой разной последовательности, поэтому они могут образовывать громадное количество разнообразных белков. Число изомеров, которое можно получить при всевозможных перестановках указанного числа аминокислот в полипептиде, исчисляется огромными величинами. Так, если из 2 аминокислот возможно образование только двух изомеров, то уже из 4 аминокислот теорети1ч8 ески возможно образование 24 изомеров, а из 20 аминокислот — 2,4 • 1018 разнообразных белков.

Нетрудно предвидеть, что при увеличении числа повторяющихся аминокислотных остатков в белковой молекуле число возможных изомеров возрастает до астрономических величин.

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Белки выполняют множество самых разнообразных функций, характерных для живых организмов, с некоторыми из которых мы познакомимся более подробно при дальнейшем изучении курса. Ниже рассматриваются главные и в некотором смысле уникальные биологические функции белков, несвойственные или лишь частично присущие другим классам биополимеров.

Каталитическая функция. К 1995 г. было идентифицировано более 3400 ферментов. Большинство известных в настоящее время ферментов, называемых биологическими катализаторами, является белками. Эта функция белков, хотя и не оказалась уникальной, определяет скорость химических реакций в биологических системах .

Транспортная функция. Дыхательная функция крови, в частности перенос кислорода, осуществляется молекулами гемоглобина—белка эритроцитов.

Защитная функция. Основную функцию защиты в организме выполняет иммунная система, которая обеспечивает синтез специфических защитных белков-антител в ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков. Высокая специфичность взаимодействия антител с антигенами (чужеродными веществами) по типу белок-белковое взаимодействие способствует узнаванию и нейтрализации биологического действия антигенов. Защитная функция белков проявляется и в способности ряда белков плазмы крови, в частности фибриногена, к свертыванию. В результате свертывания фибриногена образуется сгусток крови, предохраняющий от потери крови при ранениях.

Сократительная функция. В акте мышечного сокращения и расслабления участвует множество белковых веществ. Однако главную роль в этих жизненно важных процессах играют актин и миозин—специфические белки мышечной ткани. Сократительная функция присуща не только мышечным белкам, но и белкам цитоскелета, что обеспечивает тончайшие процессы жизнедеятельности клеток (расхождение хромосом в процессе митоза).

Структурная функция. Белки, выполняющие структурную (опорную) функцию, занимают по количеству первое место среди других белков тела человека. Среди них важнейшую роль играют фибриллярные белки, в частности коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже, эластин в сосудистой стенке и др. Большое значение имеют комплексы белков с углеводами в формировании ряда секретов: мукоидов, муцина и т.д. В комплексе с липидами (в частности, с фосфолипидами) белки участвуют в образовании биомембран клеток.

Гормональная функция. Обмен веществ в организме регулируется разнообразными механизмами. В этой регуляции важное место занимают гормоны, синтезируемые не только в железах внутренней секреции, но и во многих других клетках организма (см.

Питательная (резервная) функция. Эту функцию выполняют так называемые резервные белки, являющиеся источниками питания для плода, например белки яйца (овальбумины). Основной белок молока (казеин) также выполняет главным образом питательную функцию. Ряд других белков используется в организме в качестве источника аминокислот, которые в свою очередь являются предшественниками биологически активных веществ, регулирующих процессы метаболизма.

Можно назвать еще некоторые другие жизненно важные функции белков. Это, в частности, экспрессия генетической информации, генерирование и передача нервных импульсов, способность поддерживать онкотическое давление в клетках и крови, буферные свойства, поддерживающие физиологическое значение рН внутренней среды, и др.

Таким образом, из этого далеко не полного перечня основных функций белков видно, что указанным биополимерам принадлежит исключительная и разносторонняя роль в живом организме. Если попытаться выделить главное, решающее свойство, которое обеспечивает многогранность биологических функций белков, то следовало бы назвать способность белков строго избирательно, специфически соединяться с широким кругом разнообразных веществ. В частности, эта высокая специфичность белков (сродство) обеспечивает взаимодействие ферментов с субстратами, антител с антигенами, транспортных белков крови с переносимыми молекулами других веществ и т.д. Это взаимодействие основано на принципе биоспе- цифического узнавания, завершающегося связыванием фермента с соответствующей молекулой субстрата, что содействует протеканию химической реакции. Высокой специфичностью действия наделены также белки, которые участвуют в таких процессах, как дифференцировка и деление клеток, развитие живых организмов, определяя их биологическую индивидуальность.

СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ

Наиболее богаты белковыми веществами ткани и органы животных.

В мышцах, легких, селезенке, почках на долю белков приходится более 70—80% от сухой массы, а во всем теле человека—45% от сухой массы (табл. 1.1) . В отличие от животных тканей в растениях содержится значительно меньше белков (табл. 1.2). Органы и ткани от сухой массы от общего коли-чества белка тела Органы и ткани от сухой массы от обще-го коли-чества белка тела Кожа 63 11,5 Почки 72 0,5 Кости (твердые ткани) 20 18,7 Поджелудочная 47 0,1 Зубы (твердые ткани) 18 0,1 железа Поперечнополосатые 80 34,7 Пищеварительный 63 1,8 мышцы тракт Мозг и нервная ткань 45 2,0 Жировая ткань 14 6,4 Печень 57 3,6 Остальные ткани: Сердце 60 0,7 жидкие 85 1,4 Легкие 82 3,7 плотные 54 14,6 Селезенка 84 0,2 Все тело 45 100 Таблица 1.1. Содержание белков в органах и тканях человека

Содержание белков, %

Содержание белков, %

Таблица 1.2. Содержание белков в органах животных и в растениях Органы животных Содержание белков, % от массы свежей ткани Органы растений Содержание белков, % от массы свежей ткани Мышцы 18-23 Семена 10-13 Печень 18-19 Стебли 1,5-3,0 Селезенка 17-18 Листья 1,2-3,0 Почки 16-18 Корни 0,5-3,0 Легкие 14-15 Фрукты 0,3-1,0 Мозг 7-9

Для изучения химического состава, строения и свойств белков их обычно выделяют или из тканей, или из культивируемых клеток, или биологических жидкостей, например сыворотки крови, молока, мышц, печени, кожи и др. Элементный состав белков в пересчете на сухое вещество представлен 50—54% углерода, 21—23% кислорода, 6,5—7,3% водорода, 15—17% азота и до 0,5% серы. В составе некоторых белков присутствуют в небольших количествах фосфор, железо, марганец, магний, йод и др.

Таким образом, помимо углерода, кислорода и водорода, входящих в состав почти всех органических полимерных молекул, обязательным компонентом белков является азот, в связи с чем белки принято обозначать как азотсодержащие органические вещества. Содержание азота более или менее постоянно во всех белках (в среднем 16%), поэтому иногда определяют количество белка в биологических объектах по содержанию белкового азота.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также для изучения их химического состава и структуры непременным условием является получение белков из природных источников в химически чистом, гомогенном состоянии. Последовательность операций по выделению белков обычно состоит в следующем: измельчение биологического материала (гомогенизация); извлечение белков, точнее, перевод белков в растворенное состояние (экстракция); выделение исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистка и получение индивидуального белка.

Белковые вещества весьма чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов (органические растворители, кислоты, щелочи). Поэтому обычные методы органической химии, применяемые для выделения того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, кристаллизация и др.), в данном случае неприемлемы. Белки в этих условиях подвергаются денатурации, т.е. теряют некоторые существенные природные (нативные) свойства, в частности растворимость, биологическую активность. Разработаны эффективные методы выделения белков в «мягких» условиях, при низкой температуре (не выше 4°С), с применением щадящих нативную структуру химических реагентов.

Гомогенизация биологического материала

Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно измельчают до гомогенного состояния, т.е. подвергают дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной структуры. Эту процедуру, называемую гомогенизацией, проводят при помощи ножевых гомогенизаторов типа Уорринга или пестикового гомогенизатора Поттера—Эльвегейма. Для выделения ряда белков из плотных животных и растительных объектов часто используют валковые или шаровые мельницы (рис. 1.1). Успешно применяется также метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, в основе действия которого лежит разрушение клеточной оболочки, вызванное кристаллами льда. Для дезинтеграции тканей используют также ультразвук, пресс-методы (замороженный биоматериал пропускают через мельчайшие отверстия стального пресса под высоким давлением) и метод «азотной бомбы», при котором клетки (в частности, микробные) сначала насыщают азотом под высоким давлением, затем резко сбрасывают давле- ние—выделяющийся газообразный азот как бы «взрывает» клетки.

Экстракция белков

Современные методы измельчения тканей обычно сочетают с одновременной экстракцией белков из гомогенатов тканей. Большинство белков тканей хорошо растворимо в 8—10% растворах солей. При экстракции белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты — вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами.

Из органических соединений, помимо давно применяемых водных растворов глицерина, широко используют (особенно для солюбилизации) слабые растворы сахарозы. На растворимость белков при экстракции большое влияние оказывает рН среды, поэтому в белковой химии применяют фосфатные, цитратные, боратные буферные смеси со значениями рН от кислых до слабощелочных, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков. Особенно широкое распространение получили трис-буферные системы, представляющие собой смеси 0,2 М раствора трис-(оксиметил)-аминометана (НОСН2)3СНН2 (сокращенно обозначают «трис») с 0,1 М раствором хлороводородной кислоты в разных соотношениях. Для выделения белков сыворотки крови используют способы их осаждения этанолом (см. метод Кона), ацетоном, бутанолом и их комбинации. Почти все органические растворители разрывают белок-липидные связи, способствуя лучшей экстракции белков.

Для получения из биологического материала белков в чистом, гомогенном, состоянии применяют различные детергенты, способствующие расщеплению белок-липидных комплексов и разрыву белок-белковых связей . В частности, для освобождения белков (ферментов), прочно связанных с биомембранами митохондрий или других субклеточных структур, применяют тритон Х-100, додецилсульфат натрия и дезоксихолат натрия.

СН3—(СН2)10—СН2—О—5О3Ыа Додецилсульфат натрия

С8Н17—(С6Н4)—О—(СН2—СНОН)юН Тритон Х-100

Рис. 1.1. Лабораторное оборудование.

б

а—пестиковый ручной гомогенизатор: 1 — пестик, 2—корпус, 3 — мотор, 4—штатив; механический гомогенизатор (б) и шаровая мельница (в): 1 — корпус с электродвигателем и пусковым устройством, 2 — камера для измельчения материала.

Следует, однако, иметь в виду, что детергенты, вызывая разрыв белок- белковых связей, разрушают олигомерную (четвертичную) структуру белков.

Фракционирование и очистка белков

После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению — фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию и др.

Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. По химическим и физическим свойствам вода, входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистого растворителя. В частности, температура замерзания ее составляет —40°С. В этой воде хуже растворяются сахара, соли и другие вещества. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок.

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимо- логии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении).

На величину высаливания белков оказывают влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура. Считают, что главную роль при этом играет валентность ионов. Действие разных ионов принято сравнивать не по молярной концентрации соли, а по так называемой ионной силе ф), которая равна половине суммы произведений концентрации каждого иона (с) на квадрат его валентности (V):

Более тонкое разделение белков плазмы крови человека на фракции достигается при использовании различных концентраций этанола при низкой температуре (от —3 до —5°С) по методу Кона (рис. 1.2). В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Указанным методом часто пользуются для получения отдельных фракций крови, используемых в качестве кровезаменителей.

Рис. 1.2. Диаграмма фракционирования белков плазмы крови человека этанолом (по методу Кона).

В последнее время наибольшее распространение получили хроматографические и электрофоретические методы разделения белков.

Хроматография. Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке .

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-де-сорбции).

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству) — в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов.

Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в стеклянную вертикальную трубку (колонку) и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку —

Элюент^

компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте. Затем приступают к стадии освобождения—десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты (рис. 1.3). Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

Распределительная хроматография. В отличие от адсорбционной твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Один из типов распределительной хроматографии, как и адсорбционная, осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в под-ходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые вещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки. Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно вещество, соединяют для выделения этого вещества в чистом виде.

Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ (рис. 1.4). В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги. Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол—уксусная кислота—вода в определенных соотношениях). При движении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.

Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются поли-мерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола и целлюлозы, несущие функциональные группы:

СНа-0-С2Н41ЧН(С2Н5)2

Триметиламинополистирол

Диэтиламиноэтилцеллюлоза

(ДЭАЭ-целлюлоза)

Аналогичные функциональные группы содержат триэтиламиноэтил (ТЭАЭ)- и аминоэтил (АЭ)-целлюлозы.

Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами (производные винилбензола или дивинилбензола) и карбоксиметилцеллю- лозой, имеющими следующие функциональные группы:

СН2—О ^СН^-СОО

В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают с колонки, применяя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.

Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), широко используются в фармакологии (при создании и определении лекарственных веществ), в клинической биохимии (при определении биологически активных веществ в физиологических жидкостях), в биотехнологических процессах и производствах и других областях: они позволяют определять вещества в нано-, пико- и фемтаграммных количествах.

Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами—лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носи-телем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинством метода является возможность одноэтапно выделить заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты. При помощи аффинной хроматографии, например, удалось сравнительно легко выделить очищенные препараты аминоацил-тРНК-синтетаз на полиакрилгидразидагаровом геле, к которому в качестве лигандов были присоединены определенные тРНК (транспортные РНК).

Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек- страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку. Разделение веществ этим методом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки; небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой:

= У0 + К* V

где V — объем элюирующей жидкости вещества с данным К, мл; V0 — свободный объем колонки или общий объем внешнего растворителя (вне зерен геля), мл; V — объем растворителя внутри геля, мл; К — коэффициент распределения для растворенного вещества между растворителем внутри зерен геля и окружающим растворителем. Если анализируемую пробу, содержащую одно растворенное вещество с К =1 и второе с К = 0, внести в колонку с сефадексом, то второе вещество появится в элюирующей жидкости сразу после выхода из колонки У0, а первое—только после выхода объема У0 + Уг

Поскольку молекулы белков, обладающие большими молекулярной массой и размерами, не диффундируют внутрь зерен сефадекса, они первыми вымываются из колонки после выхода свободного объема колонки У0, в то время как все остальные вещества (включая низкомолекулярные примеси) вымываются после выхода объема, равного У0 + К • Уг

Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии. С помощью сефадекса можно разделить белки с разной молекулярной массой.

Электрофорез. Метод свободного электрофореза, детально разработанный лауреатом Нобелевской премии А. Тизелиусом, основан на различии в скорости движения (подвижности) белков в электрическом поле, которая

Рис. 1.5. Гель-хроматография на колонке с сефадексом (схема).

Большие светлые кружки с крестиками - зерна сефадекса; малые черные и красные кружки и треугольники - белки с различной молекулярной массой; А - колонка в начале работы; Б, В, Г - колонка в различные периоды времени. На графике элюции четко видно разделение белковых компонентов.

определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. В последнее время более широкое распространение получили методы зонального электрофореза белков на различных носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе. Преимущества их по сравнению с методом свободного электрофореза состоят в том, что исключается размывание границы белок-растворитель в результате диффузии и конвекции, не требуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка (подробно эти методы и соответствующая аппаратура рассматриваются в практиче-ских руководствах по биохимии).

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. ШзсопИпиоиз - прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями рН и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле - 10, а в полиакриламидном геле - до 18 разных белковых фракций.

Для выявления белков при электрофорезе в гелях их обрабатывают одним из следующих красителей: бромфеноловым синим, амидо черным 10В, кислотным синим 83, кумасси бриллиантовым голубым К-250 и др. Интенсивность окраски и соответственно относительное содержание каждой белковой фракции обычно определяют денситометрически путем прямого сканирования на денситометре. В последние годы стали применять методы электрофореза белков с градиентом концентрации геля, что значительно повышает разрешающую способность, особенно при фракционировании белков с высокой молекулярной массой, превышающей 50000— 100000.

Весьма перспективными методами разделения белков (как и определения ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода изоэлектрического фокусирования - изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом рН. Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении рН равен нулю. При использовании

метода изоэлектрического фокусирования применяют смеси синтетических полиаминополикарбоновых кислот (амфолины) для создания градиента рН в диапазоне от 3,0 до 10,0.

В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск- электрофореза в полиакриламидном геле—методы двухмерного электрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций.

Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей. Для полного освобождения белков от низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при мед-ленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков . Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекулярных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.

Определение гомогенности белков

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому- либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в виде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая

и т.д.), то эти данные с большой долей вероятности могут свидетельствовать об однородности исследуемого белка.

В основе иммунохимического метода контроля гомогенности исследуемого белка лежит реакция преципитации его с соответствующей антисывороткой, полученной от иммунизированных этим белком животных. Для строгого доказательства гомогенности белка требуется одновременное использование нескольких методов.

Не потерял своего значения и метод кристаллизации белков с использованием сульфата аммония, а также метод определения растворимости белка. Последний, предложенный еще Д. Нортропом , основан на правиле фаз Гиббса, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от количества вещества, находящегося в твердой фазе. Метод может быть выполнен сравнительно легко и быстро в микромасштабах. Обычно определяют растворимость увеличивающегося количества исследуемого белка при постоянном количестве растворителя.

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ

Несмотря на то что первая аминокислота—глицин—была выделена А. Бра- конно еще в 1820 г. из кислотного гидролизата желатина, полный аминокислотный состав белков был расшифрован только к 30-м годам XX в. Большая заслуга в этом принадлежит работам Н.Н. Любавина, который в 1871 г. установил, что под действием ферментов пищеварительных соков белки расщепляются на аминокислоты.

Были сделаны два важных вывода: 1) в состав белков входят аминокислоты; 2) методами гидролиза может быть изучен химический, в частности амнокислотный, состав белков.

Для изучения аминокислотного состава белков пользуются сочетанием кислотного (НС1), щелочного [Ва(ОН)2] и, реже, ферментативного гидролиза или одним из них. Установлено, что при гидролизе чистого белка, не содержащего примесей, освобождаются 20 различных а-аминокислот. Все другие открытые в тканях животных, растений и микроорганизмов аминокислоты (более 300) существуют в природе в свободном состоянии либо в виде коротких пептидов или комплексов с другими органическими веществами.

а-Аминокислоты представляют собой производные карбоновых кислот, у которых один водородный атом, у а-углерода, замещен на аминогруппу (—КИ2), например:

Р—СН2—СН2—СООИ К—СН—СООН

NN3

а-Аминокислота

Следует подчеркнуть, что все аминокислоты, входящие в состав природных белков, являются а-аминокислотами, хотя аминогруппа в свободных аминокарбоновых кислотах может находиться, как увидим ниже, в Р-, у-, би е-положениях.

Классификация аминокислот

Все встречающиеся в природе аминокислоты обладают общим свойством - амфотерностью (от греч. ашрЬо1его§ - двусторонний), т.е. каждая аминокислота содержит как минимум одну кислотную и одну основную группы. Общий тип строения а-аминокислот может быть представлен в следующем виде:

И"—С—N Н2

Как видно из общей формулы, аминокислоты будут отличаться друг от друга химической природой радикала К, представляющего группу атомов в молекуле аминокислоты, связанную с а-углеродным атомом и не участвующую в образовании пептидной связи при синтезе белка. Почти все а-амино- и а-карбоксильные группы участвуют в образовании пептидных связей белковой молекулы, теряя при этом свои специфические для свободных аминокислот кислотно-основные свойства. Поэтому все разнообразие особенностей структуры и функции белковых молекул связано с химической природой и физико-химическими свойствами радикалов аминокислот. Именно благодаря им белки наделены рядом уникальных функций, не свойственных другим биополимерам, и обладают химической индивидуальностью.

Классификация аминокислот разработана на основе химического строения радикалов, хотя были предложены и другие принципы. Различают ароматические и алифатические аминокислоты, а также аминокислоты, содержащие серу или гидроксильные группы. Часто классификация основана на природе заряда аминокислоты. Если радикал нейтральный (такие аминокислоты содержат только одну амино- и одну карбоксильную группы), то они называются нейтральными аминокислотами. Если аминокислота содержит избыток амино- или карбоксильных групп, то она называется соответственно основной или кислой аминокислотой.

Современная рациональная классификация аминокислот основана на полярности радикалов (К-групп), т.е. способности их к взаимодействию с водой при физиологических значениях рН (близких к рН 7,0). Различают 5 классов аминокислот, содержащих следующие радикалы: 1) неполярные (гидрофобные); 2) полярные (гидрофильные); 3) ароматические (большей частью неполярные); 4) отрицательно заряженные и 5) положительно заряженные. В представленной классификации аминокислот (табл. 1.3) приведены наименования, сокращенные английские и русские обозначения и однобуквенные символы аминокислот, принятые в отечественной и иностранной литературе, а также значения изоэлектрической точки (р1) и молекулярной массы (М). Отдельно даются структурные формулы всех 20 аминокислот белковой молекулы. Аминокислоты Принятые сокращенные обозначения и однобуквенные символы М/р! Среднее содержание в белках, % англ. символ русск. I. Неполярные К-группы Глицин С1у о Гли 75/5,97 7,5 Аланин А1а А Ала 89/6,02 9,0 Валин Уа1 У Вал 117/5,97 6,9 Лейцин Геи ь Лей 131/5,97 7,5 Изолейцин Не I Иле 131/5,97 4,6 Пролин Рго Р Про 115/6,10 4,6 II. Полярные, незаряженные К-группы

Серин 8ег 8 Сер 105/5,68 7,1 Треонин ТЬг Т Тре 119/6,53 6,0 Цистеин Сук С Цис 121/5,02 2,8 Метионин Ме! М Мет 149/5,75 1,7 Аспарагин Акп N Асн 132/5,41 4,4 Глутамин С1п 0 Глн 146/5,65 3,9 III. Ароматические К- группы

Фенилаланин РЬе р Фен 165/5,98 3,5 Тирозин Туг V Тир 181/5,65 3,5 Триптофан Тгр № Трп 204/5,88 1,1 ГУ. Отрицательно заря-женные К-группы

Аспарагиновая Акр Б Асп 133/2,97 5,5 кислота

Глутаминовая С1и Е Глу 147/3,22 6,2 кислота

У. Положительно заря-женные К-группы

Лизин Гук К Лиз 146/9,74 7,0 Аргинин Агд К Арг 174/10,76 4,7 Гистидин Шк Н Гис 155/7,59 2,1 Неполярные П-группы

1_-глутамин

о=с-снгТсн-соон 1

I *¦ I I

Отрицательно заряженные Р-группы

НОООСНг-СН2тСН-СООН | ! мн, I

НООС-СН21СН-СООН

I I

ЫНг I

1_-аспарагиновая кислота

Положительно заряженные Р-группы

( I 1

СН,-СНЭ-СН,-СН5+СН~СООН ! /=*т-СНг-СН-СООН ] Ь1Н2 ^ 1 НМч,М I

1_-гистидин

NN ,

С-МН-СН,-СН,-СН,+СН-СООН

^ . !Г4Н2 ¦

1_-аргинин I

Ароматические Р-группы

1_-триптофан

Перечисленные аминокислоты присутствуют в разных количественных соотношениях и последовательностях в тысячах белков, хотя отдельные индивидуальные белки не содержат полного набора всех этих аминокислот. Помимо наличия в большинстве природных белков 20 аминокислот, в некоторых белках обнаружены производные аминокислот : оксипролин, оксилизин, дийодтирозин, фосфосерин и фосфотреонин (последние две аминокислоты представлены в главе 2):

СНэ-СН-(СН2)2-СН-СООН

и^>н 1|н2

Оксилизин

Первые две аминокислоты содержатся в белке соединительной ткани - коллагене, а дийодтирозин является основой структуры гормонов щитовидной железы. В мышечном белке миозине обнаружен также е-М-метиллизин; в состав протромбина (белок свертывания крови) входит у-карбоксиглута- миновая кислота, а в глутатионпероксидазе открыт селеноцистеин, в котором ОН-группа серина заменена на селен (8е):

7

Помимо указанных, ряд а-аминокислот выполняет важные функции в обмене веществ, хотя и не входит в состав белков, в частности орнитин, цитруллин, гомосерин, гомоцистеин, цистеинсульфиновая кислота, диокси- фенилаланин и др.

Общие свойства аминокислот

Кислотно-основные свойства. Эти свойства аминокислот определяют многие физико-химические и биологические свойства белков. На этих свойствах основаны, кроме того, почти все методы выделения и идентификации аминокислот. Аминокислоты легко растворимы в воде. Они кристаллизуются из нейтральных водных растворов в форме биполярных (амфотер- ных) ионов (цвиттерионов), а не в виде недиссоциированных молекул (последнюю структуру приводят для удобства представления, однако все аминокислоты при физиологических значениях рН имеют структуру цвитте- риона).

Н—С-КН2

I

СООН

При растворении в воде кристаллическая аминокислота, например аланин, может реагировать или как кислота (донатор протона):

+1ЧН3СН(СН3)СОО-<=> Н+ + 1ЧН2СН(СН3)СОО-, или как основание (акцептор протона):

+ЫН3СН(СН3)СОО-+Н+<=>+ЫН3СН(СН3)СООН.

Если радикалы аминокислот нейтральные, то они почти не оказывают влияния на диссоциацию а-карбоксильной группы или а-аминогруппы, и величины рК (отрицательный логарифм константы диссоциации) остаются относительно постоянными. Вследствие этого кривые диссоциации почти всех нейтральных аминокислот накладываются друг на друга и могут быть рассмотрены на примере аланина. Если к раствору аланина (например,

1 М) в воде постепенно прибавлять сильную кислоту (0,1 М раствор НС1) или сильную щелочь (0,1 М раствор №ОН), то получим кривую титрова-ния аланина, типичную для всех нейтральных аминокислот (рис. 1.6).

Кажущиеся величины рК' для а-карбоксильной группы и а-аминогрупп (т.е. значения рН, при которых эти группы в среднем наполовину диссоциированы) довольно сильно различаются, составляя рК1 = 2,34 и рК2 = 9,69. При низком значении рН (ниже рК1') почти все молекулы аланина являются полностью протонированными и несут положительный заряд. Другими словами, при высокой концентрации водородных ионов в растворе тенденция к диссоциации водорода из структуры аланина оказывается незначительной. Из кривой титрования видно, что точка перехода между ветвями

кривой располагается при рН 6,02. Это означает, что при данном значении рН суммарный (или средний) электрический заряд молекулы аланина равен нулю и она не перемещается в электрическом поле ни к аноду, ни к катоду (изоэлектрическое состояние). Такое значение рН получило название изо- электрической точки и обозначается р1. Изоэлектрическая точка аминокислот, не содержащих дополнительных N4.,- или СООН-групп, представляет собой среднее арифметическое между двумя значениями рК':

рК'соон + рк'мн,

р| = 2 ’

соответственно для аланина

2,34 + 9,69 „

р| = 2 6’

Изоэлектрическая точка ряда других аминокислот, содержащих дополнительные кислотные или основные группы (аспарагиновая и глутаминовая кислоты, лизин, аргинин, тирозин и др.), зависит, кроме того, от кислотности или основности радикалов этих аминокислот. Для лизина, например, р1 должна вычисляться из полусуммы значений рК' для а- и е-КН2-групп. Таким образом, в интервале рН от 4,0 до 9,0 почти все аминокислоты существуют преимущественно в форме цвиттерионов с протонированной аминогруппой и диссоциированной карбоксильной группой. Следует отме-

Рис. 1.6. Кривые, полученные при титровании 0,1 М раствора аланина 0,1 М раствором НС1 (а) и 0,1 М раствором №ОН (б).

тить, что при физиологических значениях рН тканей и крови (7,1 и 7,4 соответственно) аминокислоты (за ислючением гистидина) не обладают измеримой буферной емкостью. Эту способность они приобретают только при значениях рН, близких к величинам их рК (т.е. при рН 1,7—3,2 и 8,6-10,8).

Стереохимия аминокислот. Важнейшим свойством аминокислот, освобождающихся в процессе гидролиза природных белков в условиях, исключающих рацемизацию, является их оптическая активность. Будучи растворенными в воде (или в НС1), они способны вращать плоскость поляризованного луча (исключение составляет глицин). Это свойство связано с наличием в молекуле всех природных аминокислот (за ислючением глицина) в а-положении асимметрического атома углерода (т. е. атома углерода, все четыре валентные связи которого заняты различными заместителями). Величины удельного вращения вправо или влево являются количественной характеристикой оптической активности, и для большинства аминокислот составляет от 10 до 30°. Примерно половина аминокислот белков оказалась правовращающей, их обозначают знаком «+» (Ала, Иле, Глу, Лиз и др.), а чуть меньше половины—левовращающей (Фен, Трп, Лей и др.), их обозначают знаком «—». Все эти аминокислоты принадлежат к Ь-ряду, а величина и знак оптического вращения зависят от природы радикалов аминокислот и значения рН раствора, в котором измеряют оптическое вращение.

Стереохимию аминокислот принято оценивать не по оптическому вращению, а исходя из абсолютной конфигурации всех четырех замещающих групп, расположенных вокруг асимметрического атома углерода в верши-нах модели тетраэдра. Абсолютную конфигурацию аминокислот принято соотносить стереохимически с соединением, произвольно взятым для сравнения, а именно с глицериновым альдегидом, также содержащим асимметрический атом углерода. Ниже представлены Ь- и Б-стереоизомеры глицеринового альдегида. Рядом показаны пространственные конфигурации Ь- и Б-аланина:

образом, природные аминокислоты имеют пространственное расположение, аналогичное конфигурации Ь-глицеринового альдегида. Следует еще раз подчеркнуть, что символы Ь и Б означают принадлежность данной аминокислоты по своей стереохимической конфигурации к Ь- или Б-ряду, в то время как знак «+» или «-» указывает на направление изменения плоскости поляризации светового луча. Среди белковых аминокислот имеются две аминокислоты (треонин и изолейцин), которые содержат по два асимметрических атома углерода. Следовательно, если не в природе, то, во всяком случае, в лаборатории возможно получить четыре стереоизо- мерные формы этих аминокислот . Для треонина известны все четыре изомера. Если условно обозначить символом Ь выделенный из природных белков треонин, то его зеркальное отображение называют Б-треонином. Два других изомера, получивших наименование диастереоизомеров, или аллоформ, также могут иметь Ь- и Б-формы. Структурные конфигурации всех четырех стереоизомеров треонина можно представить следующими формулами:

СООН

1 СООН с-н 1

Н-С-ГШ2 с-н н-с-он

1 1

СНз 1

СНз но-

1_-треонин Э-треонин 1-аллотреонин Э-аллотреонин

Как отмечалось, в белковой молекуле Б-аминокислоты не обнаружены , однако в живой природе они широко распространены.

Так, Б-изомеры глутаминовой кислоты, аланина, валина, фенилаланина, лейцина и ряда других открыты в клеточной стенке бактерий; в составе некоторых антибиотиков, в частности актиномицинов, бацитрацина, грами- цидинов А и 8, содержатся аминокислоты Б-конфигурации.

Аминокислотный состав (качественный и количественный) многих тысяч белков, полученных из разных источников, выяснен (табл. 1.4).

При анализе данных табл. 1.4 виден ряд закономерностей. На долю дикарбоновых аминокислот и их амидов в большинстве белков приходится до 25-27% всех аминокислот. Эти же аминокислоты вместе с лейцином и лизином составляют около 50% всех аминокислот. В то же время на долю таких аминокислот, как цистеин, метионин, триптофан, гистидин, приходится не более 1,5-3,5%. В протаминах и гистонах отмечено высокое содержание основных аминокислот аргинина и лизина, соответственно 26,4 и 85,2% (см. «Химия простых белков»).

Химические реакции для открытия и определения аминокислот в гидролизатах белков. В курсе органической химии подробно рассмотрено множество химических реакций, характерных для а-амино- и а-карбоксильных групп аминокислот (ацилирование, алкилирование, нитрование, этерификация

Таблица 1.4. Аминокислотный состав некоторых природных белков, в процентах Белок

Аминокислота Саль-

мин Гистон

(печень

телен-

ка) Казеин Альбу-мин (сы-воротка человека) у-Гло-

булин

(чело

века) Пепсин Инсу

лин Колла-

ген Аланин 1,1 7,6 3,2 — — 4,5 9,5 Глицин 2,9 5,8 2,0 1,6 4,2 6,4 4,3 27,2 Валин 3,1 5,5 7,2 7,7 9,7 7,1 7,7 3,4 Лейцин 0 9,1 9,2 11,0 9,3 10,4 13,2 — Изолейцин 1,6 4,6 6,1 1,7 2,7 10,8 2,8 5,6 Пролин 5,8 3,4 10,6 5,1 8,1 5,0 2,5 15,1 Фенилаланин 0 3,5 5,0 7,8 4,6 6,4 8,8 2,5 Тирозин 0 3,9 6,3 4,7 6,8 8,5 13,0 1,0 Триптофан 0 - 1,2 0,2 2,9 2,4 0 0 Серин 9,1 4,1 6,3 3,3 11,4 12,2 5,2 3,4 Треонин 0 6,4 4,9 4,6 8,4 9,6 2,1 2,3 Цистеин + цистин 0 — 0,3 6,3 3,1 2,1 12,5 0 Метионин 0 0,9 2,8 1,3 1,1 1,7 — 0,8 Аргинин 85,2 14,8 4,1 6,2 4,8 1,0 3,1 8,6 Гистидин 0 2,3 3,1 3,5 2,5 0,9 4,9 0,7 Лизин 0 11,7 8,2 12,3 8,1 0,9 2,5 4,5 Аспарагиновая кислота 0 5,5 7,1 9,0 8,8 16,0 6,8 6,3 Глутаминовая кислота 0 10,3 22,4 17,0 11,8

1,1 11,9 18,6 11,3 Амидный азот 0 0,7 1,6 0,9 1,3 1,4 0,7

и др.). Здесь будут рассмотрены общие цветные реакции для обнаружения индивидуальных аминокислот и аминокислот, входящих в состав белков, основанные на химической природе радикалов аминокислот (табл. 1.5).

Для открытия в биообъектах и количественного определения аминокислот успешно применяется реакция их с нингидрином. На I стадии реакции образуется восстановленный нингидрин за счет окислительного дезаминирования аминокислот (параллельно происходит декарбоксилирование аминокислот):

На II стадии образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярными количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя сине-фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570 нм) про-порциональна количеству аминокислоты:

На основе нингидриновой реакции были разработаны методы количественного определения аминокислот, в частности метод распределительной хроматографии на бумаге, впервые внедренный в 1944 г. (А. Мартин и Р. Синдж). Эта же реакция используется благодаря своей высокой чувствительности в автоматическом анализаторе аминокислот. Впервые такой прибор сконструировали Д. Шпакман, С. Мур и У. Стейн (рис. 1.7). После разделения смеси аминокислот в колонках, заполненных специальными ионообменными смолами (сульфополистирольный катионит), ток элюента из колонки поступает в смеситель, туда же поступает раствор нингидрина; интенсивность образующейся окраски автоматически измеряется на фотоэлектроколориметре и регистрируется самописцем. Этот метод нашел широкое применение в клинической практике при исследовании крови, мочи, спинномозговой жидкости. С его помощью за 2—3 ч можно получить полную картину качественного состава аминокислот в биологи-

Таблица 1.5. Реакции, используемые для идентификации и полуколичественного определения аминокислот и белков Реакция Реактивы Определяемая

аминокислота Окраска Миллона НдМ03 в азотной кислоте в при-сутствии азотистой кислоты Тирозин Красная Ксантопротеи-

новая Кипящая концентрированная азотная кислота Фенилаланин,

тирозин Желтая Гопкинса-

Коула Глиоксиловая кислота в кон-центрированной серной кислоте Триптофан Сине-фиоле-

товая Эрлиха п-Диметиламинобензальдегид в концентрированной хлорис-товодородной кислоте Триптофан Синяя Сакагучи а-Нафтол и гипохлорит натрия Аргинин Красная Нитропрус-

сидная Нитропруссид натрия в разбав-ленном растворе аммиака Цистеин Красная Салливена 1,2-Нафтохинон-4-сульфонат натрия и бисульфит натрия Цистеин » Паули Диазотированная сульфанило- вая кислота в щелочном растворе Гистидин,

тирозин » Фолина-

Чокалтеу Фосфомолибденово-вольфра- мовая кислота Тирозин Синяя

Рис. 1.7. Работа автоматического анализатора аминокислот (принципиальная схема по Шпакману, Муру и Стейну).

1 - смеситель; 2 - фотоэлектроколориметр; 3 - самописец.

ческих жидкостях и выявить наличие в них необычных азотсодержащих веществ, что имеет важное диагностическое и прогностическое значение.

Автоматические анализаторы аминокислот все время совершенствуются, повышаются чувствительность методов и скорость проведения анализа. Так, в современных приборах высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) удается проводить анализ гидролизата белка за 45 мин, определяя при этом концентрацию аминокислот в пикомолях (рис. 1.8).

Смесь аминокислот может быть успешно разделена также методом электрофореза на бумаге. При рН 6,0 возможно хорошее разделение кислых и основных аминокислот с нейтральными. В этом случае отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты будут двигаться к аноду, а положительно заряженные—к катоду. Нейтральные аминокислоты остаются на линии старта.

Для их разделения электрофорез обычно проводят при рН 1,8—2,0, когда все они мигрируют к аноду с незначительным, но уловимым различием в подвижности. После электрофореза местоположение аминокислот на электофореграмме выявляют с помощью химических реакций, а после элюции окрашенных продуктов определяют их количественно.

Рис. 1.8. ВЭЖХ аминокислот по Цеху и Вольтеру. Разделение на колонке (3 х 250 мм), наполненной ионообменной смолой - поли- стиролдивинилбензолом. Концент-рация аминокислот 500 пмоль/л, реактив для детектирования - флюорескамин, образующий с аминогруппой сильно флюоресцирующее соединение.

1 - Асп; 2 - Тре; 3 - Сер; 4 - Глу; 5 - Гли; 6 - Ала; 7 - Цис; 8 - Вал; 9 - Мет; 10 - Иле; 11 - Лей; 12 - Тир; 13 - Фен; 14 - Лиз; 15 - Гис; 16 - Арг.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление, способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм (это свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, используется для количественного определения белков).

Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных МИ2- и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований. В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положительный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Растворы белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных методах микроскопии биологических объектов. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических поражениях, например, почек капсула почечного клубочка (Шумлянского- Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови и последние появляются в моче.

Молекулярная масса белков

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц. Их мол. масса варьирует в широких пределах—от 6000 до 100000 и более.

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молекулярной массы белков методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах , в которых удается создать центробежные ускорения (§), превышающие в 200000 и более раз ускорение земного притяжения. Обычно вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница растворитель- белок (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя и белка используются при определении скорости седиментации; последнюю выражают через константу седиментации 8, которая зависит как от массы, так и от формы белковой частицы:

V

где V—скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; ю — угловая скорость ротора, рад/с; г — расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1 • 10-13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (8). Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1—50 8, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 8.

Для вычисления молекулярной массы (М), помимо константы седиментации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

где К — газовая постоянная, эрг/(моль • град); Т — абсолютная температура (по шкале Кельвина); я—константа седиментации; р — плотность растворителя; V — парциальный удельный объем молекулы белка; Б - коэффициент диффузии.

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель- хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молекулярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как показано на рис. 1.9.

Известно, что между логарифмом молекулярной массы белка, имеющего сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависимость. Поэтому легко определить молекулярную массу исследуемого белка, зная его объем элюции. Второй разновидностью этого метода является тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка (в миллиметрах)

Рис. 1.9. Измерение объема элюции (у^)-

Рис. 1.10. Зависимость между длиной пробега белковых частиц при гель-хроматографии в тонком слое сефадекса Г-150 (сверхтонкого) и их молекулярными массами (в полулогарифмической системе координат).

1 - рибонуклеаза; 2 - химотрипсиноген; 3 - яичный альбумин; 4 - сывороточный альбумин; 5 - у-глобулин; Х - белок с неизвестной молекулярной массой.

через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от молекулярной массы белка (рис. 1.10).

Гель-хроматография, кроме простоты и быстроты, имеет дополнительное преимущество: не требуется выделять белок в чистом виде, так как примеси других белков не мешают определению, поскольку каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимо- логии, когда оказывается возможным определение молекулярной массы даже очень небольшого количества фермента в присутствии других белков, не обладающих аналогичной каталитической активностью.

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка.

0,2 0,4 0,6 0,8

Относительная подвижность

Рис. 1.11. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат).

1 - сывороточный альбумин; 2 - яичный альбумин; 3 - пепсин; 4 - химотрипсиноген; 5 - мио- глобин; 6 - цитохром с; Х - белок с неизвестной молекулярной массой.

Недавно предложен новый масс-спектрометрический метод (так называемый лазерный десорбционно-ионизационный метод), позволяющий определять молекулярную массу небольших пептидов (вазопрессин, инсулин) и крупных биополимерных молекул и, кроме того, структуру биомолекул.

Форма белковых молекул

О величине и форме белковых молекул раньше судили по данным ультрацентрифугирования, двойного лучепреломления и диффузии. Эти данные указывали на существование в природе глобулярных (шарообразных) и фибриллярных (нитевидных) белков. В настоящее время общие представления о форме белковых молекул в основном подтвердились, однако только современные методы исследования позволили установить детали прост-ранственной конфигурации (трехмерной структуры) белковых молекул. Благодаря применению сканирующей микроскопии и рентгеноструктурного анализа (высокое разрешение, порядка 0,2—0,3 нм) удалось в деталях расшифровать не только полную пространственную структуру, форму, но и степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях. Оказалось, что даже глобулярные белки крови (гемоглобин, альбумины и глобулины) являются асимметричными в указанных измерениях. Следует отметить, что не только физико-химические, но и биологические свойства белков (в свободном или в связанном друг с другом или с другими биополимерами состоянии) определяются их пространственной структурой.

Денатурация белков

Природные белковые тела наделены определенной, строго заданной пространственной конфигурацией и обладают рядом характерных физико-химических и биологических свойств при физиологических значениях температуры и рН среды. Под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует понимать нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка, преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характерных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.). Большинство белков денатурирует при нагревании их растворов выше 50—60°С.

Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных 8Н-групп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При денатурации белка, вызванной 8М мочевиной или другим агентом, разрушаются в основном нековалентные связи (в частности, гидрофобные взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разрываются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры (рис. 1.12).

При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирующих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением

а - исходное состояние; б - начинающееся обратимое нарушение молекулярной структуры; в - необратимое развертывание поли- пептидной цепи.

Рис. 1.13. Денатурация и ре- натурация рибонуклеазы (по Анфинсену).

а - развертывание (мочевина + меркаптоэтанол); б - повторное свертывание.

исходной трехмерной структуры и нативных свойств его молекулы (рис. 1.13), включая биологическую активность. Таким образом, при денатурации белковая молекула полностью теряет биологические свойства, демонстрируя тем самым тесную связь между структурой и функцией. Для практических целей иногда используют процесс денатурации в «мягких» условиях, например при получении ферментов или других биологически активных белковых препаратов в условиях низких температур в присутствии солей и при соответствующем значении рН . При лиофилизации белков (высушивание в вакууме путем возгонки влаги из замороженного состояния) для предотвращения денатурации часто пользуются химическими веществами (простые сахара, глицерин, органические анионы).

Изоэлектрическая и изоионная точки белков

В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотер- ными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом поле. Зная аминокислотный состав белка, можно приближенно определить изоэлектрическую точку (р1); р1 является характерной константой белков. Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пределах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых значения изоэлектрических точек лежат в крайних значениях рН среды. В частности, величина р1 пепсина (фермент желудочного сока) равна 1, а сальмина (основной белок из молоки семги)—почти 12.

В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее величину не влияет концентрация белка.

В химии белков существует понятие «изоионная точка белка». Раствор белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов, образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от посторонних ионов обычно его раствор пропускают через колонку, наполненную смесью анионо- и катионообменников. Изоионной точкой данного белка принято называть значение рН изоионного раствора этого белка:

где [Р] — молярная концентрация белка; 2 — средний заряд молекулы. Согласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его концентрации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда р1 равно 7, не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ

Выяснение структурной организации белков считается одной из главных проблем современной биохимии. Оно имеет важное научно-практическое значение для понимания огромного разнообразия функций белков, выполняемых ими в живых организмах. Белковые молекулы представляют собой продукт полимеризации 20 различных мономерных молекул (аминокислот), соединенных не хаотично, а в строгом соответствии с кодом белкового синтеза (см. главу 14). Вопрос о том, каким образом соединяются между собой многие десятки и сотни аминокислот в белковой молекуле, был предметом пристального внимания многих лабораторий мира, занимавшихся химией белка.

Впервые А.Я. Данилевский (1888), изучая биуретовую реакцию, высказал предположение о существовании во всех белковых веществах одинаковых групп атомов и связей, аналогичных биурету КН2—СО—КН—СО—КН2. Тем самым А.Я. Данилевский первый указал на связь —КН—СО— (позднее получившую название пептидной связи) как на наиболее вероятный способ соединения аминокислот в белковой молекуле.

Однако только Э. Фишер (1902) сформулировал полипептидную теорию строения. Согласно этой теории, белки представляют собой сложные полипептиды, в которых отдельные аминокислоты связаны друг с другом пептидными связями, возникающими при взаимодействии а-карбоксильных

СООН- и а-МН2-групп аминокислот. На примере взаимодействия аланина и глицина образование пептидной связи и дипептида (с выделением молекулы воды) можно представить следующим уравнением:

снз-сн—соон н2м-сн2 ^2° СН3-СН-[СОЕМНЬСН2

1 + I —I I

NN2 СООН N42 СООН

Аланин Глицин Аланилглицин

Аналогичным способом к дипептиду могут присоединяться и другие аминокислоты с образованием три-, тетра-, пентапептида и т.д. вплоть до крупной молекулы полипептида (белка). Наименование пептидов складывается из названия первой М-концевой аминокислоты со свободной МН2- группой (с окончанием -ил, типичным для ацилов), названий последующих аминокислот (также с окончаниями -ил) и полного названия С-концевой аминокислоты со свободной СООН-группой. Например, пентапептид из 5 аминокислот может быть обозначен полным наименованием: глицил- аланил-серил-цистеинил-аланин, или сокращенно Гли—Ала—Сер—Цис—Ала .

Образование пептидных связей, например, из трех разных аминокислот может быть представлено в виде следующей схемы:

Химический синтез полипептидов и современные физико-химические методы исследования белков полностью подтвердили существование пептидных связей в структуре белка. Получены следующие экспериментальные доказательства полипептидной теории строения белка.

В природных белках сравнительно мало титруемых свободных СООН- и МН2-групп, поскольку абсолютное их большинство находится в связанном состоянии, участвуя в образовании пептидных связей; титрованию доступны в основном свободные СООН- и МН2-группы у М- и С- концевых аминокислот пептида.

В процессе кислотного или щелочного гидролиза белка образуются стехиометрические количества титруемых СООН- и МН2-групп, что свидетельствует о распаде определенного числа пептидных связей.

Под действием протеолитических ферментов (протеиназ) белки рас-щепляются на строго определенные фрагменты, называемые пептидами, с концевыми аминокислотами, соответствующими избирательности действия протеиназ. Структура некоторых таких фрагментов неполного гидролиза доказана последующим химическим их синтезом.

Биуретовую реакцию (сине-фиолетовое окрашивание в присутствии раствора сульфата меди в щелочной среде) дают как биурет, содержащий пептидную связь, так и белки, что также является доказательством наличия в белках аналогичных связей.

Анализ рентгенограмм кристаллов белков подтверждает полипептид- ную структуру белков. Таким образом, рентгеноструктурный анализ при разрешении 0,15-0,2 нм позволяет не только вычислить межатомные расстояния и размеры валентных углов между атомами С, Н, О и К, но и «увидеть» картину общего расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи и пространственную ее ориентацию (конформацию).

Существенным подтверждением полипептидной теории строения белка является возможность синтеза чисто химическими методами полипептидов и белков с уже известным строением: инсулина - 51 аминокислотный остаток, лизоцима - 129 аминокислотных остатков, рибонуклеазы - 124 аминокислотных остатка *. Синтезированные белки обладали аналогичными природным белкам физико-химическими свойствами и биологической активностью.

Полипептидная теория строения не отрицает существования в молекуле белка и других связей, включая ковалентные (например, дисульфидные —8—8-связи) и нековалентные (например, водородные связи и др.). Они будут рассмотрены далее.

Пептидные связи играют исключительную роль как в «архитектуре», так и в функции белков. Поэтому следует указать на некоторые особенности строения полипептидной цепи. Во-первых, это своеобразие расположения атомов углерода и азота, находящихся примерно в одной плоскости, и атомов водорода и радикалов, направленных к этой плоскости под углом 109°28'. Во-вторых, это своеобразие петидной связи. Расстояние между атомами С и N в пептидной связи (равное 0,132 нм) является промежуточным между простой (ординарной) связью (связь —С—К—, равная

147 нм) и двойной связью (связь —С=К—, равная 0,125 нм). Это создает предпосылки для осуществления по месту двойной связи таутомерных перегруппировок и для образования енольной (лактимной) формы. Последняя в свою очередь дает молекуле белка ряд преимуществ (повышение реакционной способности, возникновение дополнительных возможностей вращения и др.):

Лактамная (кетонная) форма

Лактимная (енольная) форма

Наконец, следует указать на своеобразие радикалов, которые являются полифункциональными, несущими свободные NН2-, СООН-, ОН-, 8Н- группы и, как было указано, определяют структуру (пространственную) и многообразие функций молекул белка. Взаимодействуя с окружающими молекулами растворителя (Н2О), функциональные группы (в частности, NН2- и СООН-группы) ионизируются, что приводит к образованию анионных и катионных центров белковой молекулы. В зависимости от соотношения ионов молекулы белка получают суммарный положительный (+) или отрицательный (—) заряд с определенным значением изоэлектрической точки.

Получены доказательства предположения К. Линдерстрёма-Ланга о существовании 4 уровней структурной организации белковой молекулы: первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры. Техника современной белковой химии разработана настолько хорошо, что позволяет в принципе расшифровать структурную организацию любого белка.

Первичная структура белка

К настоящему времени расшифрована первичная структура десятков тысяч разных белков, что является несомненным достижением биохимии. Однако

1 А12

это число ничтожно мало, если учесть, что в природе около 10 разнообразных белков. Под первичной структурой подразумевают порядок, последовательность расположения аминокислотных остатков в полипеп- тидной цепи. Зная первичную структуру, местоположение каждого остатка аминокислоты, можно точно написать структурную формулу белковой молекулы, если она представлена одной полипептидной цепью. Если в состав белка входит несколько полипептидных цепей, объединенных в одну белковую молекулу посредством дисульфидных связей и нековалентных взаимодействий, или если одна полипептидная цепь содержит внутренние дисульфидные связи, то задача определения первичной структуры несколько осложняется, так как необходимо предварительное разъединение этих цепей и связей. Разъединение таких полипептидных цепей производят с помощью денатурирующих агентов (растворы 8М мочевины или 6М гуанидингидрохлорида), разрывающих нековалентные связи. Дисульфид- ные связи разрушают путем окисления или восстановления (надмуравьиной кислотой или Р-меркаптоэтанолом соответственно), при этом образуются свободные полипептиды, содержащие или остатки цистеиновой кислоты, или цистеина:

м-

N

Для определения первичной структуры отдельной, химически гомогенной полипептидной цепи в первую очередь методами гидролиза выясняют аминокислотный состав, точнее, соотношение каждой из 20 аминокислот в образце гомогенного полипептида. Затем приступают к определению химической природы концевых аминокислот полипептидной цепи, содержащей одну свободную NН2-группу и одну свободную СООН-группу.

Методы определения Ы-концевой аминокислоты

Для определения природы К-концевой аминокислоты предложен ряд методов, в частности метод Сэнджера (Р. 8ап§ег), основанный на реакции арилирования полипептида 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ), что приводит к образованию окрашенного в желтый цвет 2,4-динитрофенильного производного К-концевой аминокислоты . Раствор полипептида обрабатывают ДНФБ, который взаимодействует со свободной КН2-группой К-концевой аминокислоты пептида.

N02

-СН-СО-МН-СН-СО—мн-сн-соон

Рп

к2

Полипептид(белок)

V

N02

"N02

нгд-сн-со—мн-сн-со МН-СН-СООН

I I

К2 Кп

Гидролиз + Свободные аминокислоты

, N02

НГ^-СН-СООН

I

К|

Динитрофениламинокислота

После кислотного гидролиза продукта реакции—динитрофенилпептида только одна К-концевая аминокислота оказывается связанной с реактивом в виде 2,4-динитрофениламинокислоты (стабильной при гидролизе). В отличие от других образовавшихся при гидролизе полипептида свободных аминокислот она желтого цвета. Ее идентифицируют методом хроматографии.

Для определения К-концевой аминокислоты значительно более широко применяется фени лтиогидантоиновый метод Эдмана благодаря своей высокой чувствительности и возможности многократного использования в одной и той же пробе. Фенилизотиоцианат реагирует со свободной а-КИ2-группой К-концевой аминокислоты полипептида с образованием фенилтиокарбамоилпептида.

N=0=3 + НгМ-СН-СО^Н-СН-СО NN-04-0004

1 I

Фенилизотиоцианат I П0липептид

N4 СО—N4—ОН—СО N4—04-0004

I1 * I

Г,^С\ /СН-Р, Р2 Рп

N4

НС1 х

N С=0 >.V Н2N-СН-С0 N4-04-0004

I |

^С\ /СН-«1 р2 Рл

“ N4

фенилпТ1исэгид;антоиновое Полипептид, укороченный

производное на одну аминокислоту

^концевой АМК ’ ’

Обработка продукта реакции кислотой приводит к циклизации и освобождению фенилтиогидантоина ^концевой аминокислоты, природу которого устанавливают хроматографически. Укороченный на одну аминокислоту полипептид подвергают дальнейшему анализу.

Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с Оконца можно повторять многократно, идентифицируя последовательно одну аминокислоту за другой. Метод Эдмана используется в качестве химической основы для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован в специальном приборе — секвенаторе (от англ. зедиепсе — последовательность), работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить последовательность аминокислот с Оконца пептида до 50—60 аминокислотных остатков.

Кроме этих реактивов, для определения чередования аминокислот используют цианат калия, 1-диметиламинонафтил-5-сульфонилхлорид—дан- силхлорид и дабсилхлорид. Для этих же целей иногда применяют ферменты экзопептидазы, в частности аланин- и лейцинаминопептидазу. Эти ферменты разрывают пептидные связи с того конца полипептида, где имеется свободная NН2-группа, освобождая ^концевую аминокислоту (механизм действия экзопептидаз см. в главе 12).

Методы определения С-концевой аминокислоты

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии.

Предложен также химический метод Акабори (8. АкаЪоп), который основан на гидразинолизе полипептида:

н2м-сн-со<-мн-сн-со)п-(\т-сн-соон+<п+|)н2г*-гш2

I I

р, р* 0Нд Гидразин

—> (п+1)Н!М-СН-С0 + НэМ-СН-СООН

NN-N42 СНз

Аминоацилгидразины Аланин

Гидразин, вызывая распад чувствительных к нему пептидных связей полипептида, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С- концевой аминокислоты, поскольку ее карбоксильная группа не участвует в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь аминоацил- гидразинов и свободной С-концевой аминокислоты. Последнюю после обработки всей смеси ДНФБ отделяют и идентифицируют хроматографически, для чего образовавшиеся динитрофенилпроизводные аминоацил- гидразинов предварительно экстрагируют уксусно-этиловым эфиром.

С-концевую аминокислоту идентифицируют также путем обработки полипептида восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия. В простейшей форме эту процедуру можно представить в следующем виде:

Н2М-СН-СО-(МН-СН-СО)п-МН-СН-СО МН-СН-СООН

^ I I

ЫаВИ,

Н2М-СН-СО-(МН-СН-СО>п-МН-СН-СО МН-СН-СНгОН

I

6М НС1, 105°С, 24ч

Н21Ч-СН-СООН (Н2М-СН-СООН)п Н2М-СН-СООН н2«-СН-СНоОН

+1 +1 + I

К| К* К р

Свободные аминокислоты

Видно, что в указанных условиях только одна, а именно С-концевая, аминокислота будет превращаться в а-аминоспирт, легко идентифицируемый методом хроматографии. Таким образом, при помощи указанных методов определяют природу N и С-концевых аминокислот.

Следующий этап работы связан с определением чередования (последо-вательности) аминокислот внутри полипептидной цепи. Для этого сначала проводят избирательный, частичный (химический и ферментативный), гидролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты, последовательность аминокислот в которых может быть точно определена описанными ранее методами.

Химические методы избирательного и неполного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селективный, высокоспецифический разрыв пептидных связей, образованных определенными аминокислотами, оставляя незатронутыми остальные пептидные связи. К этим избирательно гидролизующим веществам относятся цианогенбромид, €N61 (по остаткам метионина), гидроксиламин (по связям между остатками аспарагиновой кислоты и глицина), ^бромсукцина-

мид (по остаткам триптофана). Метионина в составе белков содержится обычно меньше, чем других аминокислот, поэтому обработка СКВг предпочтительнее, так как при этом образуется небольшое число пептидов, первичную структуру которых определяют с помощью рассмотренных ранее методов, всякий раз начиная с определения природы К- и С-концевых аминокислот.

Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности действия протеолитических (вызывающих распад белков) ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами. В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин — аргинина и лизина, химотрипсин—триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В результате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами, получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основании определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах.

Метод составления пептидных карт, получивший образное название «метод отпечатков пальцев», используется при определении сходства или различия гомологичных белков по первичной структуре. Белок инкубируют с каким-либо протеолитическим ферментом. Часто порции белка инкубируют как с пепсином, так и с трипсином. При этом вследствие гидролиза строго определенных пептидных связей образуется смесь коротких пептидов, легко разделяемых с помощью хроматографии в одном направлении и электрофореза — в другом, под углом 90° от первого (пептидная карта).

Дальнейшие задачи — установление последовательности расположения аминокислот в каждом из выделенных пептидов (фенилтиогидантоиновым или другими методами), сопоставление полученных данных и установление первичной структуры всей молекулы.

Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определения последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмотрена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой важной проблемы — определение последовательности аминокислот в белковой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной последовательности ДНК. Этому способствуют как методы быстрого секвенирования ДНК, так и техника изолирования и доступности самого гена .

В настоящее время выяснение первичной структуры белков является вопросом времени и технического оснащения лабораторий. Полностью выяснена первичная структура многих природных белков и прежде всего инсулина, содержащего 51 аминокислотный остаток [Сэнджер Ф., 1954]. Более крупным белком с выясненной первичной структурой оказался иммуноглобулин, в четырех полипептидных цепях которого насчитывается 1300 аминокислотных остатков. За эту работу Дж. Эдельман и Р. Портер были удостоены Нобелевской премии (1972).

Рис. 1.14. Структура проинсулина.

Расшифрованы первичные структуры миоглобина человека (153 аминокислотных остатка), а-цепи (141) и Р-цепи (146) гемоглобина человека, цитохрома С из сердечной мышцы человека (104), лизоцима молока человека (130), химотрипсиногена быка (245) и многих других белков, в том числе ферментов и токсинов. На рис. 1.14 представлена последовательность аминокислотных остатков проинсулина. Видно, что молекула инсулина (выделена темными кружками), состоящая из двух цепей (А—21 и В — 30 аминокислотных остатков), образуется из своего предшественника — проинсулина (84 аминокислотных остатка), представленного одной полипеп- тидной цепью, после отщепления от него пептида, состоящего из 33 аминокислотных остатков. Строение молекулы инсулина (51 аминокислотный остаток) схематически можно представить следующим образом:

А-цепь (21)

В-цепь (30)

Между цепями А и В и внутри А-цепи инсулина образуются дисуль- фидные (—8—8—) связи. Выяснена первичная структура более 18 инсули-

нов, выделенных из разных источников. Близкими по первичной структуре оказались инсулины из поджелудочной железы человека, свиньи и кашалота. Единственным отличием инсулина человека является нахождение треонина в положении 30 В-цепи вместо аланина.

Вторым белком, первичная структура которого расшифрована С. Муром и У. Стейном, является рибонуклеаза (рис. 1.15) из поджелудочной железы, катализирующая расщепление РНК. Фермент состоит из 124 аминокислотных остатков с М-концевым лизином и С-концевым валином, между остатками цистеина образуются дисульфидные (—8—8—) связи в 4 участках.

Полностью расшифрована последовательность аминокислот полипеп- тидной цепи фермента лизоцима, имеющего важное защитное и медицинское значение, так как он вызывает лизис ряда бактерий, расщепляя основное вещество их клеточной оболочки. Лизоцим белка куриного яйца содержит 129 аминокислот (рис. 1.16) с М-концевым лизином и С-концевым лейцином.

Отечественными исследователями установлена первичная структура многих белков и полипептидов, в том числе крупного белка РНК-полимера- зы (в частности, последовательности ее в- и р'-субъединиц, 1342 и 1407

50

Рис. 1.15. Первичная структура РНКазы. Цветом выделены четыре дисульфидные связи.

Рис. 1.16. Первичная структура полипептидной цепи лизоцима (схема).

аминокислотных остатков соответственно фактора элонгации О из Е.соН (701 аминокислота) (Ю.А. Овчинников и др.), фермента аспартатамино- трансферазы, состоящей из 412 аминокислотных остатков (А.Е. Браун- штейн, Ю.А. Овчинников и др.), леггемоглобина, белка Ь25 из рибосом Е.соН, нейротоксинов из яда кобры (Ю.А. Овчинников и др.), пепсиногена и пепсина (В.М. Степанов и др.), Ь-липотропина и лактогенного гормона быка (Н.А. Юдаев, Ю.А. Панков) и др.

Исследования первичной структуры а- и р-цепей гемоглобина способствовали выяснению структуры необычных, так называемых аномальных, гемоглобинов, встречающихся в крови больных гемоглобинопатиями. Иногда развитие болезни, как и изменение пространственной структуры гемоглобина человека, обусловлено заменой лишь одной какой-либо аминокислоты в структуре р-цепей (реже а-цепей) гемоглобина (см. главу 2).

Анализ данных о первичной структуре белков позволяет сделать следующие общие выводы.

Первичная структура белков уникальна и детерминирована генетически. Каждый индивидуальный гомогенный белок характеризуется уникальной последовательностью аминокислот: частота замены аминокислот приводит не только к структурным перестройкам, но и к изменениям физико-химических свойств и биологических функций.

Стабильность первичной структуры обеспечивается в основном глав-новалентными пептидными связями; возможно участие небольшого числа дисульфидных связей.

В полипептидной цепи могут быть обнаружены разнообразные комбинации аминокислот; в полипептидах относительно редки повторяющиеся последовательности.

В некоторых ферментах, обладающих близкими каталитическими свойствами, встречаются идентичные пептидные структуры, содержащие неизменные (инвариантные) участки и вариабельные последовательности аминокислот, особенно в областях их активных центров. Этот принцип структурного подобия наиболее типичен для ряда протеолитических ферментов: трипсина, химотрипсина и др. (см. главу 4).

В первичной структуре полипептидной цепи детерминированы вторичная, третичная и четвертичная структуры белковой молекулы, определяющие ее общую пространственную конформацию.

Вторичная структура белка

Рентгеноструктурная кристаллография решает две главные проблемы белковой химии: закономерности чередования последовательности аминокислотных остатков в полипептидной цепи и закономерности конфигурации белковой молекулы.

Первые рентгенограммы белков, полученные еще в 30-х годах У. Астбю- ри, а затем Л. Полингом и Р. Кори, позволили установить наличие в белках наряду с линейной полипептидной цепью участков, определенным образом скрученных.

Под вторичной структурой белка подразумевают конфигурацию поли- пептидной цепи, т. е. способ свертывания, скручивания (складывание, упаковка) полипептидной цепи в спиральную или какую-либо другую конформацию. Процесс этот протекает не хаотично, а в соответствии с программой, заложенной в первичной структуре. Подробно изучены две основные конфигурации полипептидных цепей, отвечающих структурным требованиям и экспериментальным данным: а-спирали и в-структуры.

Благодаря исследованиям Л. Полинга наиболее вероятным типом строения глобулярных белков принято считать а-спираль (рис. 1.17). Закручивание полипептидной цепи происходит по часовой стрелке (правый ход спирали), что обусловлено Ь-аминокислотным составом природных белков. Движущей силой в возникновении а-спиралей (так же как и в-структур) является способность аминокислот к образованию водородных связей. В структуре а-спиралей открыт ряд закономерностей. На каждый виток (шаг) спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка. Шаг спирали (расстояние вдоль оси) равен 0,54 нм на виток, а на один аминокислотный остаток приходится 0,15 нм. Угол подъема спирали 26°, через 5 витков спирали (18 аминокислотных остатков) структурная конфигурация полипеп- тидной цепи повторяется. Это означает, что период повторяемости (или идентичности) а-спиральной структуры составляет 2,7 нм.

Для каждого белка характерна определенная степень спирализации его полипептидной цепи. Степень спирализации устанавливают путем измерения удельного вращения плоскости поляризованного света. Изменение

18 остатков

Рис. 1.17. Структура и параметры а-спирали.

последнего находится в прямой зависимости от степени спирализации белковой молекулы. Не все глобулярные белки спирализованы на всем протяжении полипептидной цепи. В молекуле белка а-спиральные участки чередуются с линейными. В частности, если а- и в-цепи гемоглобина спирализованы, например, на 75%, то лизоцима—на 42%, а пепсина—всего на 30%.

Таким образом, стабильность вторичной структуры обеспечивается в основном водородными связями (определенный вклад вносят и главновалентные связи—пептидные и дисульфидные).

Водородная связь представляет собой слабое электростатическое притяжение (взаимодействие, связь) между одним электроотрицательным атомом (например, кислородом или азотом) и водородным атомом, ковалентно связанным со вторым электроотрицательным атомом. Типы водородных связей представлены далее.

По современным представлениям, водородная связь включает не только электростатические силы притяжения между полярными группами (взаимо-действие атомов водорода с электроотрицательными элементами: кислородом, азотом, хлором), но и электронные связи такого же типа, как в ряде комплексных соединений. Водородные связи, являясь нековалентными, отличаются малой прочностью. Так, если для разрыва химических межатомных связей необходимо затратить от 84 до 8400 кДж, то для разрыва одной водородной связи требуется затратить всего лишь 6,3 кДж на 1 моль. Поскольку в белковой молекуле число водородных связей очень велико (в образование водородных связей вовлечены все пептидные группы), они в сумме обеспечивают скручивание полипептидной цепи в спиральную структуру, сообщая ей компактность и стабильность.

Механизм возникновения водородных связей в элементарной форме может быть представлен на примере взаимодействия двух молекул воды (диполи). В диполе воды, как известно, избыток положительных зарядов приходится на атомы водорода, а избыток отрицательных—на атомы кислорода.

Благодаря особенностям строения атома водорода при достаточном сближении двух молекул воды возникает электростатическое взаимодействие между атомом кислорода одной молекулы и атомом водорода второй молекулы воды. Следствием этого является ослабление связи между атома-ми водорода и кислорода в каждой молекуле воды и соответственно возникновение новой, непрочной связи (отмечена пунктиром) между атомом водорода первой молекулы и атомом кислорода второй молекулы воды. Эту непрочную связь принято обозначать водородной связью.

В белковой молекуле наиболее важные водородные связи образуются между ковалентно связанным атомом водорода, несущим частичный положительный заряд, и отрицательно заряженным ковалентно связанным атомом кислорода. Ниже представлены примеры водородных связей в белковой молекуле: а) между пептидными цепями; б) между двумя гидроксильными группами; в) между ионизированной СоОН-группой и ОН-груп- пой тирозина; г) между ОН-группой серина и пептидной связью.

НС-Р Р-СН / N

0=сч /МН

^м-н-о=с

Р-СН ХСН-Р

\

СН-Р

СН2-0-Н—о=с^

в

В зависимости от химической природы атома-акцептора водородные связи отличаются друг от друга степенью прочности. О количестве водородных связей в белковой молекуле судят по данным изотопного метода, в частности по времени обмена атомов водорода, участвующих в образовании водородной связи, на дейтерий (при обработке белка тяжелой водой Б20, в которой вместо обычного водорода содержится его тяжелый изотоп дейтерий).

Другой тип конфигурации полипептидных цепей, обнаруженный в белках волос, шелка, мышц и в других фибриллярных белках, получил название Р-структуры. В этом случае две или более линейные полипеп- тидные цепи, расположенные параллельно или, чаще, антипараллельно, прочно связываются межцепочечными водородными связями между КН- и СО-группами соседних цепей, образуя структуру типа складчатого слоя (рис. 1.18).

Рис. 1.18. в-Структура полипеп тидных цепей.

В природе существуют белки, строение которых, однако, не соответствует ни в-, ни а-структуре. Типичным примером таких белков является коллаген—фибриллярный белок, составляющий основную массу соединительной ткани в организме человека и животных (см. главу 21).

Методами рентгеноструктурного анализа в настоящее время доказано существование еще двух уровней структурной организации белковой молекулы, оказавшихся промежуточными между вторичной и третичной структурами. Это так называемые надвторичные структуры и структурные домены.

Надвторичные структуры представляют собой агрегаты полипептидных цепей, обладающих собственной вторичной структурой и образующихся в некоторых белках в результате их термодинамической или кинетической стабильности. Так, в глобулярных белках открыты (вхв)-элементы (представлены двумя параллельными в-цепями, связанными сегментом х), вавав-элементы (представлены двумя сегментами а-спирали, вставленными между тремя параллельными в-цепями) и др. В больших глобулярных белках иногда содержатся неодинаковые структурные домены, выполняющие разные функции, как и однотипные домены в пределах одного мономерного белка, образующиеся, вероятнее всего, как результат влияния генов в первом случае или дупликации генов — во втором. Домены создаются объединением и чередованием а-спиралей и в-слоев, между которыми открываются более рыхлые структуры (рис. 1.19).

Домен—это компактная глобулярная структурная единица внутри полипептидной цепи. Домены могут выполнять разные функции и подвергаться складыванию (свертыванию) в независимые компактные глобулярные структурные единицы, соединенные между собой гибкими участками внутри белковой молекулы. Открыто много белков (например, иммуноглобулины), состоящих из разных по структуре и функциям доменов, кодируемых разными генами.

Третичная структура белка

Под третичной структурой белка подразумевают пространственную ориентацию полипептидной спирали или способ укладки полипептидной цепи в определенном объеме. Поскольку ни первичная структура, ни типы спиралей или сочетания спиральных и линейных участков полипептидной

Рис. 1.19. Доменное строение глобулярных белков (по А. А. Болдыреву).

а - в-субъединица гемоглобина; б - константный домен иммуноглобулина; в - флаводоксин; г - лизоцим куриного яйца.

цепи не дают представления об объеме, форме полипептидной цепи, перед исследователем всегда стоит необходимость определения трехмерной или пространственной конфигурации белка. Основную роль в решении этих задач сыграл рентгеноструктурный анализ с высокой разрешающей способностью. Как было отмечено, метод успешно решает две главные проблемы химии белков: закономерность последовательностей аминокислотных остатков в полипептиде и закономерность конфигурации молекулы белка. Межатомные расстояния в молекулах органических веществ составляют 0,1—0,2 нм, а максимальная разрешающая способность современных аппаратов равна 0,2 нм. Это не позволяет установить местоположение каждого атома, хотя вполне могут быть различимы отдельные сочетания атомов, особенно при введении в молекулу белков атомов тяжелых металлов

Рис. 1.20. Модель третичной структуры молекулы миоглобина (по Дж. Кендрью). Латинскими буквами обозначены структурные домены, красным цветом — гем.

(последние благодаря своей высокой электронной плотности используются в качестве точек отсчета при математической обработке рентгенограмм).

Первым белком, третичная структура которого была выяснена Дж. Кендрью на основании рентгеноструктурного анализа, оказался мио- глобин кашалота. Это сравнительно небольшой белок с мол. м. 16700, содержащий 153 аминокислотных остатка (полностью выяснена первичная структура), представленный одной полипептидной цепью. Основная функция миоглобина — перенос кислорода в мышцах. Полипептидная цепь миоглобина (рис. 1.20) представлена в виде изогнутой трубки, компактно уложенной вокруг гема (небелковый компонент, содержащий железо; см. главу 2).

На протяжении последних десятилетий в связи с повышением разрешающей способности рентгеноструктурного метода была расшифрована третичная структура более 1000 белков, в том числе гемоглобина, пепсина, химотрипсина, рибонуклеазы, лизоцима, трипсина и его ингибитора, ряда фрагментов иммуноглобулинов человека, цитохрома С, карбоангидразы человека, аспартатаминотрансферазы, инсулина и др. Примеры трехмерной структуры некоторых из них представлены на рис. 1.21.

Рентгеноструктурный анализ позволяет определить конформацию и ход полипептидной цепи в пространстве, поэтому для каждого белка может быть построена объемная модель, отражающая местоположение линейных и спирализованных участков. При изучении глобулярных белков было показано, что пространственная структура белков в сильной степени зависит от ряда факторов, в частности от ионной силы и рН раствора, температуры и т.д. Новейшие методы дифракции рентгеновских лучей

позволили расшифровать кристаллическую структуру более 100 ферментов. Для выяснения трехмерной структуры белков в последнее время успешно применяются также методы низкотемпературной вычислительной техники, а также математические и компьютерные методы определения объемной структуры на основании данных последовательностей аминокислот.

В настоящее время получены бесспорные доказательства, что в стабилизации пространственной структуры белков, помимо ковалентных связей (пептидные и дисульфидные связи), основную роль играют так называемые нековалентные связи (рис. 1.22). К этим связям относятся водородные связи, электростатические взаимодействия заряженных групп, межмолеку- лярные ван-дер-ваальсовы силы, взаимодействия неполярных боковых радикалов аминокислот, так называемые гидрофобные взаимодействия и т.д.

По современным представлениям, третичная структура белка после завершения его синтеза в рибосомах (см. главу 14) формируется совершенно автоматически, самопроизвольно и полностью предопределяется первичной структурой. Основной движущей силой в возникновении трехмерной структуры является взаимодействие радикалов аминокислот с молекулами воды. При этом неполярные гидрофобные радикалы аминокислот как бы погружаются внутрь белковой молекулы, образуя там сухие зоны, в то время как полярные радикалы оказываются ориентированными в сторону воды. В какой-то момент возникает термодинамически наиболее выгодная стабильная конформация молекулы. В такой форме белковая молекула характеризуется минимальной свободной энергией. Молекулы белков в водных растворах обычно принимают ряд стабильных конформаций, индуцируемых не только изменениями рН и температуры, но и низкомолекулярными соединениями. Различают две основные формы конформаций: Т-форму (от англ. 1епзеё—напряженная) и К-форму (от англ. ге1ахеё—рас-

Рис. 1.22. Типы нековалентных связей, стабилизирующих третичную структуру белка.

а - электростатическое взаимодействие; б - водородная связь; в - гидрофобные взаимодействия неполярных групп; г - диполь-дипольные взаимодействия; д - дисульфидная (ковалентная) связь.

слабленная). Между этими формами осуществляются переходы, соответственно отражающиеся в биологических свойствах.

В процессе укладки синтезированной полипептидной цепи, получившем название фолдинга—формирование нативной пространственной структуры, в клетках происходит отбор из множества стерически возможных состояний одной-единственной стабильной и биологически активной кон-формации, определяемой, вероятнее всего, первичной структурой. Описан ряд наследственных заболеваний человека, развитие которых связывают с нарушением вследствие мутаций процесса фолдинга (пигментозы, фиброзы и др.). Поэтому в настоящее время пристальное внимание исследователей приковано к выяснению зависимости между аминокислотной последовательностью синтезированной в клетке полипептидной цепи (первичная структура) и формированием пространственной трехмерной структуры, обеспечивающей белковой молекуле ее нативные свойства. Имеется немало экспериментальных доказательств, что этот процесс не является автоматическим, как предполагалось ранее, и, вероятнее всего, регулируется и контролируется также внутриклеточными молекулярными механизмами, детали которых пока полностью не раскрыты. Из клеток выделено несколько классов белков, названных шаперонами, или белками теплового шока, которые располагаются между К-концевым сигнальным пептидом и матричным белком. Предполагается, что основными функциями шаперонов являются способность предотвращать образование из полипептидной цепи неспецифических (хаотичных) беспорядочных клубков, или агрегатов белков, и обеспечение доставки (транспорта) их к субклеточным мишеням, создавая условия для завершения свертывания белковой молекулы. Эти результаты наводят на мысль о возможности существования «второй половины генетического кода», определяя тем самым повышенный интерес исследователей к проблеме свертывания полипептидной цепи и формирования ее нативной пространственной конформации.

Таким образом, линейная одномерная структура полипептидной цепи (т.е. последовательность аминокислотных остатков, обусловленная кодом белкового синтеза) наделена информацией другого типа—конформацион- ной, которая представляет собой образование белковой молекулы строго заданной формы с определенным пространственным расположением отдельных ее частей. Другими словами, третичная—объемная—структура бел-ковой молекулы детерминирована аминокислотной последовательностью полипептидной цепи, а более конкретно—размером, формой и полярностью радикалов аминокислотных остатков. Эти представления могут служить основой для предсказания конформации белковой молекулы на основании аминокислотной последовательности. Следует указать, однако, что до сих пор представляется интригующей загадкой механизм этой тесной и тонкой связи между аминокислотной последовательностью и трехмерной структурой белковой молекулы. Оказывается, иногда полипептиды почти с одинаковыми последовательностями образуют разные структуры и, наоборот, полипептиды с разными последовательностями формируют одинаковую трехмерную структуру.

В свою очередь трехмерная структура белковой молекулы также содержит информацию, но уже совершенно нового типа, а именно функциональ-ную, которую акад. В.А. Энгельгардт назвал интрамолекулярной информацией. Как будет показано далее, все биологические свойства белков (каталитические, гормональные, антигенные и др.) связаны с сохранностью их третичной структуры, которую принято называть нативной конформацией. Любые воздействия (термические, физические, химические), приводящие к нарушению этой конформации молекулы (разрыв водородных и других нековалентных связей), сопровождаются частичной или полной потерей белком его биологических свойств.

Четвертичная структура белка

Под четвертичной структурой подразумевают способ укладки в пространстве отдельных полипептидных цепей, обладающих одинаковой (или разной) первичной, вторичной или третичной структурой, и формирование единого в структурном и функциональном отношениях макромолекулярно- го образования. Многие функциональные белки состоят из нескольких полипептидных цепей, соединенных не главновалентными связями, а нековалентными (аналогичными тем, которые обеспечивают стабильность третичной структуры). Каждая отдельно взятая полипептидная цепь, получившая название протомера, мономера или субъединицы, чаще всего не обладает биологической активностью. Эту способность белок приобретает при определенном способе пространственного объединения входящих в его состав протомеров, т.е. возникает новое качество, не свойственное мономерному белку. Образовавшуюся молекулу принято называть олигомером (или мультимером). Олигомерные белки чаще построены из четного числа протомеров (от 2 до 4, реже от 6 до 8) с одинаковыми или разными молекулярными массами — от нескольких тысяч до сотен тысяч. В частности, молекула гемоглобина состоит из двух одинаковых а- и двух в-полипептидных цепей, т.е. представляет собой тетрамер. На рис. 1.23 представлена структура молекулы гемоглобина, а на рис. 1.24 хорошо видно, что молекула гемоглобина содержит четыре полипептидные цепи,

каждая из которых окружает группу гема — пигмента, придающего крови ее характерный красный цвет (см. главу 2).

В определенных условиях (присутствие солей, 8М мочевины или резкие изменения рН) молекула гемоглобина обратимо диссоциирует на две аи две в-цепи. Эта диссоциация обусловлена разрывом водородных связей. После удаления солей или мочевины происходит автоматическая ассоциация исходной молекулы гемоглобина (рис. 1.25).

Классическим примером олигомерной молекулы, или надмолекулярной структуры, является вирус табачной мозаики, представляющий собой гигантскую молекулу с мол. м. около 40 • 106. Он состоит из одной молекулы

РНК (см. главу 3) и 2130 белковых субъединиц, масса каждой из которых составляет 17500. Длина вируса примерно 300 нм, ширина—около 17 нм. РНК вируса имеет спиралеобразную форму. Вокруг РНК нанизаны белковые частицы, образующие гигантскую надмолекулярную спиральную структуру, в которой насчитывается около 130 витков (рис. 1.26). Удивительной особенностью вируса является то, что после разъединения соответствующими приемами (добавление детергента) РНК и белковых субъединиц и последующего их смешивания (с предварительным удалением детергента) наблюдаются полная регенерация четвертичной структуры, восстановление всех физических параметров и биологических функций (инфектив- ная способность вируса). Подобная точность процесса спонтанной самосборки вируса обеспечивается, вероятнее всего, информацией, содержащейся в первичной структуре молекулы РНК и белковых субъединиц. Таким образом, последовательность аминокислот содержит в себе информацию, которая реализуется на всех уровнях структурной организации белков.

Многие ферменты также обладают четвертичной структурой, например фосфорилаза а, состоящая из двух идентичных субъединиц, в каждой из которых по две пептидные цепи. Вся молекула фосфорилазы а, таким образом, представляет собой тетрамер. Отдельные субъединицы чаще всего не обладают каталитической активностью; вообще регуляторные ферменты

да1

Рис. 1.26. Самосборка вируса табачной мозаики.

(см. главу 4) имеют четвертичную олигомерную структуру. Они наделены функцией обеспечения в клетке требуемых скоростей химических реакций.

Наиболее изученным олигомерным ферментом является лактатдегидро- геназа (она катализирует обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную), содержащая два типа полипептидных цепей: Н—сердечный тип (от англ. Ьеай—сердце) и М—мышечный тип (от англ. шизс1е—мышца) — и состоящая из 4 субъединиц. Этот фермент благодаря различным сочетаниям субъединиц может существовать в 5 формах. Такие ферменты получили название изоферментов, или, в соответствии с новой классификацией, множественных форм ферментов (см. главу 4).

К настоящему времени субъединичная структура обнаружена у нескольких сотен белков. Однако только для немногих белков, в том числе для молекулы гемоглобина, методом рентгеноструктурного анализа расшифрована четвертичная структура . Основными силами, стабилизирующими четвертичную структуру, являются нековалентные связи между контактными площадками протомеров, которые взаимодействуют друг с другом по типу комплементарности—универсальному принципу, свойственному живой природе. Структура белка после его синтеза в рибосоме может частично подвергаться модификации (посттрансляционный процессинг): например, при превращении предшественников ряда ферментов или гормонов (инсулин).

Таким образом, имеются все основания для подтверждения мнения о существовании 4 уровней структурной организации белков. Более того, каждый индивидуальный белок характеризуется уникальной структурой, обеспечивающей уникальность его функций. Поэтому выяснение структуры разнообразных белков может служить ключом к познанию природы живых систем и соответственно сущности жизни. На этом пути научного поиска могут быть решены также многие проблемы наследственных заболеваний человека, в основе которых лежат дефекты структуры и биосинтеза белков.

Некоторые исследователи склонны рассматривать, и не без основания, существование пятого уровня структурной организации белков. Речь идет о полифункциональных макромолекулярных комплексах, или ассоциатах из разных ферментов, получивших название метаболических олигомеров, или метаболонов, и катализирующих весь путь превращений субстрата (синте- тазы высших жирных кислот, пируватдегидрогеназный комплекс, дыхательная цепь).

КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

В настоящее время еще не разработана стройная система номенклатуры и классификации белков. Традиционная классификация белков по группам, основанная, скорее, на случайных показателях (физико-химические свойства, форма молекул, локализация и происхождение, аминокислотный состав), уже не отвечает полностью возросшему уровню знаний о их структуре и функциях. Из огромного количества природных белков структура и функции расшифрованы для относительно небольшого числа (не более нескольких сотен), и поэтому структура и функции белков пока не могут служить основой для их рациональной классификации. Пожалуй, только для одной группы белков, обладающих способностью катализировать химические реакции, т.е. ферментов, разработана стройная система номенклатуры и классификации, в основу которой положены типы катали-зируемых химических реакций и химическая природа реагирующих веществ. Однако полностью идентифицированные до сих пор ферменты также составляют незначительную долю белков (ферментов описано более 3000). Тем не менее функциональный принцип, рекомендуемый некоторыми авторами, хотя и не может служить универсальной основой для классификации всех белков, представляет определенный интерес. В соответствии с функциональным принципом различают 12 главных классов белков: 1) каталитически активные белки (ферменты); 2) белки-гормоны (хотя есть и стероидные гормоны); 3) белки-регуляторы активности генома; 4) защитные белки (антитела, белки свертывающей и антисвертывающей систем крови); 5) токсические белки; 6) транспортные белки; 7) мембранные белки; 8) сократительные белки; 9) рецепторные белки; 10) белки-ингибиторы ферментов; 11) белки вирусной оболочки; 12) белки с иными функциями.

Были предприняты также попытки классифицировать белки, исходя из особенностей вторичной и третичной структуры. В соответствии с этим различают а-, в-, а+в- и а/в-белки. а-Белки содержат только а-спирали (не менее 60%), в-белки — только в-структуры (не менее двух антипараллельных цепей), а+в-белки — те и другие структуры в пределах одной полипептидной цепи (пример—молекулы лизоцима), а класс а/в-белков содержит множество а- и в-структур, чередующихся вдоль полипептидной цепи или домена (см. рис. 1.19). Домены создаются объединением и чередованием а-спиралей и в-слоев, между которыми открываются более рыхлые структуры.

Учитывая необходимость для студента-медика основательного знакомства с отдельными группами белков, которые могут служить предметом изучения в его будущей профессиональной деятельности (например, белки крови), приводим старую классификацию белков с краткой характеристикой новых данных о структуре, составе и свойствах отдельных представителей. Согласно этой классификации, обширный класс белковых веществ в зависимости от химического состава делят на простые и сложные белки .

Простые белки построены из остатков аминокислот и при гидролизе распадаются соответственно только на свободные аминокислоты.

Сложные белки—это двухкомпонентные белки, которые состоят из какого-либо простого белка и небелкового компонента, называемого про- стетической группой. При гидролизе сложных белков, помимо свободных аминокислот, освобождается небелковая часть или продукты ее распада.

Простые белки в свою очередь делятся на основании некоторых условно выбранных критериев на ряд подгрупп: протамины, гистоны, альбумины, глобулины, проламины, глютелины и др. Классификация сложных белков (см. главу 2) основана на химической природе входящего в их состав небелкового компонента. В соответствии с этим различают фосфопротеины (содержат фосфорную кислоту), хромопротеины (в состав их входят пигменты), нуклеопротеины (содержат нуклеиновые кислоты), гликопротеины (содержат углеводы), липопротеины (содержат липиды) и металлопротеины (содержат металлы).

ХИМИЯ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ

Протамины и гистоны. Данная группа белков отличается рядом характерных физико-химических свойств, своеобразием аминокислотного состава и представлена в основном белками с небольшой молекулярной массой. Протамины обладают выраженными основными свойствами, обусловленными наличием в их составе от 60 до 85% аргинина. Так, сальмин, выделенный из молок семги, состоит на 85% из аргинина. Высоким содержанием аргинина отличается другой хорошо изученный белок—клу- пеин, выделенный из молок сельди: из 30 аминокислот в нем на долю аргинина приходится 21 остаток. Расшифрована первичная структура клу- пеина. Протамины хорошо растворимы в воде, изоэлектрическая точка их водных растворов находится в щелочной среде. По современным представлениям, протамины скорее всего являются пептидами, а не белками, поскольку их молекулярная масса не превышает 5000. Они составляют белковый компонент в структуре ряда сложных белков.

Гистоны также являются белками основного характера. В их состав входят лизин и аргинин, содержание которых, однако, не превышает 20—30%. Молекулярная масса гистонов намного больше нижнего предела молекулярной массы белков. Эти белки сосредоточены в основном в ядрах клеток в составе дезоксирибонуклеопротеинов и играют важную роль в регуляции экспрессии генов (см. главы 2 и 3).

Проламины и глютелины. Это белки растительного происхождения, отличаются своеобразием аминокислотного состава и физико-химических свойств. Они содержатся в основном в семенах злаков (пшеница, рожь, ячмень и др.), составляя основную массу клейковины. Характерной особен-ностью проламинов является растворимость в 60—80% водном растворе этанола, в то время как все остальные простые белки в этих условиях обычно выпадают в осадок. Наиболее изучены оризенин (из риса), глюте- нин и глиадин (из пшеницы), зеин (из кукурузы), гордеин (из ячменя) и др. Установлено, что проламины содержат 20—25% глутаминовой кислоты и 10—15% пролина.

Альбумины и глобулины. Эти белки относятся к белкам, широко распространенным в органах и тканях животных. Наиболее богаты ими белки сыворотки крови, молока, яичный белок, мышцы и др. В плазме крови человека в норме содержится около 7% белков, представленных преимущественно альбуминами и глобулинами. Альбумины и глобулины—это глобулярные белки, различающиеся по растворимости (табл. 1.6).

Необходимо отметить, что само определение «альбумины» и «глобулины» основано на их растворимости в дистиллированной воде и полунасы-

Таблица 1.6. Растворимость альбуминов и глобулинов Растворитель Альбумины Глобулины Дистиллированная вода Слабые солевые растворы №С1 Насыщенный раствор Ка,804 Насыщенный раствор КаС1 Полунасыщенный раствор (КН4)28 04 Насыщенный раствор (КН4)2804 Растворимы

»

»

»

»

Нерастворимы Нерастворимы

Растворимы

Нерастворимы

»

»

»

щенном растворе (НИ4)2804. Однако, как показывают данные табл. 1.6, глобулины растворимы только в разбавленных солевых растворах.

Различную растворимость альбуминов и глобулинов сыворотки крови раньше широко использовали в клинической практике для их фракционирования и количественного определения (см. главу 17).

В настоящее время качественный состав и содержание сывороточных белков определяют с помощью электрофореза на бумаге и в полиакриламидном геле в небольшом количестве сыворотки крови. Типичная электро- фореграмма белков сыворотки крови, а также соотношение отдельных фракций представлены в главе 17. Альбумины и глобулины отличаются друг от друга также по молекулярной массе — соответственно 40000—70000 и 150000 и более.

Из сыворотки крови не только выделен альбумин в чистом виде, но и определена первичная структура его единственной полипептидной цепи (575 аминокислотных остатков). Альбумин имеет относительно низкую изоэлектрическую точку (4,7) и высокий отрицательный заряд при рН 8,6, благодаря чему он мигрирует с большой скоростью в электрическом поле к аноду. Принято считать, что примерно 75—80% осмотического давления белков сыворотки крови приходится на альбумины; кроме того, основной функцией их считают транспорт жирных кислот. Однако точная функция альбуминов не совсем ясна. Известны случаи, когда у некоторых людей в крови фактически отсутствуют альбумины (врожденная аномалия), но они практически здоровы.

Глобулины, представленные а1-фракцией, содержатся в крови в комплексе с билирубином и с липопротеинами высокой плотности. Глобулины, мигрирующие при электрофорезе в виде а2-фракции, содержат глобулин и неизвестный гликопротеин. в-Глобулины включают ряд важных в функциональном отношении белков, в частности трансферрин—белок, ответственный за транспорт железа. С этой же фракцией связан церулоплазмин — белок, транспортирующий ионы меди. Отсутствие этого белка приводит к развитию гепатоцеребральной дистрофии, при которой наблюдается отравление организма ионами свободной меди. В основе болезни лежит врожденный дефицит синтеза церулоплазмина. Наконец, во фракции в- глобулинов содержится протромбин, являющийся предшественником тромбина —белка, ответственного за превращение фибриногена крови в фибрин при свертывании крови.

Фракция у-глобулинов является наиболее гетерогенной. Известно множество антител, различающихся первичной структурой. Электрофоретиче- ски они открываются главным образом в у-глобулиновой и частично в в2-глобулиновой фракциях. Структура и функция у-глобулинов более подробно рассмотрены далее (см. главу 2, «Гликопротеины»).

ПРИРОДНЫЕ ПЕПТИДЫ

В последние годы значительно повысился интерес к структуре и функциям встречающихся в свободном состоянии в организме низкомолекулярных пептидов, выполняющих ряд специфических биологических функций. Короткие пептиды, содержащие до 10 аминокислот, принято называть олигопептидами; в то же время полипептиды и белки считаются взаимозаменяемыми, хотя термином «полипептиды» чаще обозначают продукты с мол. м. менее 10000. В некоторых биоактивных пептидах имеются необычные аминокислоты, не встречающиеся в природных белках, или производные обычных аминокислот (гормоны, антибиотики). Мнение

о том, что пептиды могут играть роль промежуточных продуктов на пути синтеза белка, не подтвердилось, поскольку, как показано в главе 14, этот процесс во всех клетках у всех живых организмов осуществляется ёе поуо матричным путем.

Природные пептиды, наделенные биологической активностью, в зависимости от характера действия и происхождения принято делить на 4 группы:

пептиды, обладающие гормональной активностью (вазопрессин, окси- тоцин, кортикотропин, глюкагон, кальцитонин, меланоцитстимулирующий гормон, рилизинг-факторы гипоталамуса и др.; см. главу 8); 2) пептиды, принимающие участие в процессе пищеварения (в частности, гастрин и секретин; см. главу 12); 3) пептиды, источник которых—а2-глобулиновая фракция сыворотки крови (такие, как ангиотензин, брадикинин и каллидин); 4) нейропептиды.

В последнее время выяснены некоторые закономерности синтеза физиологически активных пептидов из биологически инертных предшественников — белков в результате процесса, называемого посттрансляционной модификацией (постсинтетические превращения белковой молекулы). Известно, например, что ангиотензины (представленные октапептидами), оказывающие выраженное сосудосуживающее действие, образуются из присутствующего в сыворотке крови неактивного белка ангиотензиногена в результате последовательного действия ряда протеолитических ферментов (ренина и особого фермента, участвующего в превращении неактивного ангиотензина I в активный ангиотензин II).

АНГИОТЕНЗИНОГЕН (неактивный)

Асп-Арг-Вал—Тир-Иле-Г ис—Про-Фен-Гис-Лей-Вал—Тир-Сер-полипептид

I

Ренин 1

АНГИОТЕНЗИН I (неактивный)

Асп—Арг—Вал—Тир—Иле—Г ис—Про— Фен—Г ис—Лей

I Карбокси- ^

X катепсин

АНГИОТЕНЗИН II (активный)

Асп-Арг-Вал-Т ир-Иле-Г ис-Про-Фен

К группе вазоактивных (оказывающих влияние на тонус сосудов) пептидов относятся, кроме того, широко применяемые в медицинской практике брадикинин и каллидин.

Брадикинин представляет собой нонапептид:

Н-Арг-Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про-Фен-Арг-ОН.

Каллидин представлен декапептидом, образующимся из неактивного плазменного белка кининогена, и отличается от брадикинина присутствием на Оконце еще одного аминокислотного остатка (Лиз):

Н-Лиз-Арг-Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про-Фен-Арг-ОН.

Совсем недавно из экстрактов ткани предсердия (но не из желудочков сердца) человека и животных были выделены биологически активные пептиды, регулирующие тонус сосудистой системы и электролитный обмен. Физиологический эффект их оказался противоположным влиянию системы ренин—ангиотензин—альдостерон. Он выражается в сосудорасширяющем действии, усилении клубочковой фильтрации и стимуляции выведения натрия и хлоридов за счет угнетения их реабсорбции в канальцах. Эти пептиды получили название атриопептидов (от лат. а1по — предсердие). Они построены из разного числа аминокислот (от 23 до 100), но обязательным условием для проявления биологического эффекта является наличие в молекуле 17-членной кольцевой структуры, образующейся за счет дисуль- фидной связи между остатками цистеина.

Внутриклеточным посредником действия атриопептидов оказался циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), синтез которого осуществляется в результате активирования мембранного фермента гуанилатциклазы; действие аденилатциклазы, напротив, тормозится под влиянием атриопеп- тидов.

Во всех животных тканях и в некоторых растениях широко распространен низкомолекулярный трипептид глутатион, функции которого пока не выяснены достаточно полно, хотя он открыт сравнительно давно. Глута- тион представляет собой атипичный трипептид (в котором в образовании одной из пептидных связей участвует не а-карбоксильная, а у-карбок- сильная группа глутамата) следующего строения: у-глутамил-цистеинил- глицин:

НООС-СН-СН2-СН2-СО-МН-СН-СН2 _8Н

Глутатион (восстановленный)

Цистеин является составной частью глутатиона, поэтому последний может находиться в восстановленной (8Н) и в окисленной (8-8) формах (сокращенно обозначаются Г-8Н и Г-8-8-Г), что, по-видимому, имеет отношение к биологической роли глутатиона в организме.

Интерес к природным пептидам в значительной степени обусловлен необычно высокой их биологической активностью. Они оказывают мощное фармакологическое действие на множество физиологических функций организма. В то же время были замечены низкая стабильность и быстрый распад их в организме при физиологических значениях рН среды. Все это способствовало развитию исследований как в области препаративного выделения природных пептидов из органов и тканей (включая получение биологически активных пептидов из предшественников методами ограниченного протеолиза ряда хорошо известных гормонов), так и в области химического синтеза. Получение ряда биологически активных нейропептидов из гормонов гипофиза, в частности эндорфинов и энкефалинов, наделенных мощным обезболивающим действием (путем связывания рецепторов определенных клеток мозга), в сотни и тысячи раз превосходящим аналгезирующий эффект морфина, описано в главе 8.

Из ткани мозга выделен также 6-пептид сна; ряд других нейропептидов принимает участие в биохимических механизмах памяти, страха, обучения и т.д. Для повышения стабильности пептидов при введении в организм предприняты попытки химического синтеза пептидов, в которых один или

несколько аминокислотных остатков Ь-ряда замещают остатками Б- аминокислот. Подобная замена, не вызывая снижения биоактивности, защищает пептид от воздействия протеиназ тканей, способствуя пролонгированию эффекта препарата.

Среди естественно встречающихся небольших пептидов следует указать на антибиотик грамицидин 8, выделенный из БаеШиз ЬгеУ18 и представляющий собой циклический декапептид:

фен —*¦

I

Про <—

1--Лей —*¦ 1,-Орн —> и-Вал —> Ь-Про

Вал <— 1_-Орн <— 1_-Лей *— Р-Фен

Г рамицидин 5

Как видно, в структуре грамицидина 8 имеются 2 остатка орнитина (Орн), производные аминокислоты аргинина и 2 остатка неприродных Б-изомеров фенилаланина. Стрелки указывают направление синтеза от НН2-групп к СООН-группам каждого остатка, и вследствие цикличности грамицидин 8 не имеет конца.

Широкое применение, особенно в пищевой промышленности, в качестве заменителя сахара получил искусственный (генноинженерный синтез) дипептид, состоящий из Ь-изомеров аспарагиновой кислоты и метилового эфира фенилаланина, названный аспартамом:

ноос-сн2-сн|со-мн тСН-СНг Лнг' СО-ОСНз

Аспартам

Аспартам в сотни раз слаще сахара и легко распадается в организме на две свободные аминокислоты, абсолютно безвредные для организма; поэтому он рекомендован в качестве заменителя сахара больным диабетом. Это пример пептида, наделенного огромным биологическим эффектом.