СИСТЕМА ПРОТЕИНА С ПРОТЕИН С

В 1976 г. во фракции витамин К-зависимых факторов свертывания был обнаружен белок, который был назван протеином С (ПрС). Вскоре оказалось, что этот белок идентичен описанному ранее аутопротромбину П-А и служит проферментом, который после активации тромбином специфически расщепляет факторы Уа и УШа, что приводит к прерыванию каскада реакций активации свертывания крови.

ПрС синтезируется в печени как полипептид, состоящий из 461 аминокислотного остатка, включая 42-членный сигнальный пептид, необходимый для посттрансляционного у-карбоксилиро- вания 9 остатков СНп.

участкам, его молекулярная масса составляет 62 кД. В плазме ПрС находится в 2-цепочечной форме, образующейся в результате расщепления связи Аг^^-ТИг^ в молекуле предшественника и удаления 2 С-концевых аминокислот легкой ]М-концевой цепи. Концентрация ПрС в плазме составляет ~4 мг/л, а 1^2 — 6-8 ч.

Легкая цепь ПрС состоит из СНа-домена и 2 ЕОР-доменов, которые обеспечивают связывание Са2+ с высоким сродством и взаимодействие ПрС с фосфолипидами, комплексом тромбин- тромбомодулин, протеином 5 и фактором Уа. Тяжелая цепь ПрС содержит протеолитический домен, который гомологичен другим протеазам свертывания и трипсину. Активный центр образуют остатки №521 ь Азр257 и Зегзео- ПрС обладает узкой субстратной специфичностью и с высокой скоростью расщепляет только активированные формы факторов Уа и УШа.

Активация ПрС происходит в результате расщепления связи Аг§[1б9-Ьеи17о в ]М-концевой части тяжелой цепи и сопровождается освобождением пептида активации. Впервые ПрС был активирован тромбином и протеазой из яда змеи Рассела. Однако свободный тромбин активирует ПрС с очень низкой скоростью и только в отсутствие ионов Са2+. Эндотелий сосудов в тысячи раз ускоряет активацию ПрС благодаря тромбомодулину, обеспечивающему активацию ПрС тромбином.

ТРОМБОМОДУЛИН

Тромбомодулин (ТМ) — трансмембранный гликопротеин, состоящий из 557 аминокислотных остатков.

ный 5ег/ТЬг, содержащий хондроитинсульфатную боковую цепь и участки О-гликозилирования, затем трансмембранный домен и короткий С-концевой цитоплазматический участок.

ТМ связывает тромбин с высоким сродством (Кй ~0,5 нМ). Связывание тромбина и изменение его субстратной специфичности обеспечиваются структурами 5-го и 6-го ЕОР-доменов, которые взаимодействуют с субстратсвязывающим участком активного центра тромбина, и хондроитинсульфатной цепью, которая связывается с последовательностью щелочных аминокислот тромбина. Наличие на ТМ 2 участков взаимодействия с тромбином подтверждается связыванием двух молекул тромбина с одной молекулой ТМ. Во взаимодействии с ПрС и его активации важная роль принадлежит А5Р349 4-го ЕОР-домена и области, связывающей 4-й и 5-й ЕОР-домены ТМ.

Связывание тромбина с ТМ увеличивает каталитическую эффективность реакции активации ПрС в ~ 20 ООО раз и ингибирует прокоагулянтные функции тромбина: активацию тромбоцитов, фактора V и свертывание фибриногена. ТМ, кроме изменения направленности каталитического действия тромбина, может выполнять и функцию удаления этого белка. Связывание с ТМ стимулирует эндоцитоз комплекса и разрушение тромбина лизосомальными ферментами, а также инактивацию тромбина антитромбином III.

ТМ экспрессируется в эндотелиальных клетках вен, артерий, капилляров и лимфатической системы большинства органов, за исключением головного мозга. Содержание иРНК, кодирующей ТМ, убывает в последовательности: сердце > поджелудочная железа > легкие > скелетные мышцы > почки > печень > плацента. Концентрация ТМ в микроциркуляции может достигать ~10 нМ. В следовых количествах ТМ обнаруживается также в тромбоцитах, плазме и моче.

Синтез ТМ может стимулироваться тромбином, цАМФ, ре- тиноевой кислотой, пентоксифиллином и ИЛ-4. Экспрессия ТМ может снижаться под воздействием эндотоксина, ИЛ-1, ТОТ, гипоксии и ряда инфекций.

Приемлемых для клинических исследований методов определения функциональной активности ТМ пока не предложено. В экспериментах на мышах показано, что полная инактивация гена ТМ приводит к гибели эмбрионов на стадии, предшествующей развитию ССС. Это свидетельствует о том, что функция ТМ, по-видимому, не ограничивается только контролем свертывания крови. Обнаружено, что описанный ранее поверхностный белок плода фетомодулин по структуре и свойствам идентичен ТМ. ТМ может конкурировать с клеточным рецептором за связывание с тромбином и таким образом подавлять митогенное действие тромбина и его влияние на экспрессию молекул адгезии на эндотелии. При гетерозиготной форме дефицита ТМ тромбозы у животных развивались лишь при наличии дополнительных повреждающих стимулов.

ПРОТЕИН 5

Протеин 5 (Пр5) — витамин К-зависимый белок, увеличивающий скорость инактивации протеином С факторов Уа и УШа в составе протромбиназного и Х-азного комплексов. Потенцирующий эффект наблюдают только в присутствии фосфолипидов, и функция Пр5 может заключаться в повышении сродства ПрСа к мембранам.

Пр5 синтезируется в печени, эндотелии, интерстициальных клетках семенников и мегакариоцитах. Секретируется Пр5 как обладающий активностью одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой ~80 кД, состоящий из 635 аминокислотных остатков. ]М-концевая область Пр5 характеризуется высокой степенью гомологии с другими витамин К-зависимыми белками. Она состоит из СНа-домена и 4 ЕОР-доменов. Между СНа-до- меном и 1-м ЕОР-доменом аминокислотная последовательность образует стабилизированную дисульфидным мостиком петлю,

связи которой легко расщепляются тромбином. Расщепление приводит к инактивации Пр5. В отличие от других витамин К-за- висимых белков С-концевая часть молекулы Пр5 не содержит протеазного домена.

Пр5 связывается с высоким сродством (Кй ~ 0,5 нМ) с С4Ь-связывающим белком (С4Ь-СБ) системы комплемента. В плазме около половины Пр5 находится в виде комплекса с С4Ь-СБ, который не обладает антикоагулянтной активностью. В образовании комплекса принимают участие С-концевая область Пр5 и 14-концевая область [3-цепи С4Ь-СБ. Участки связывания С4Ь-компонента находятся на а-цепях С4Ь-СБ, и связывание Пр5 не влияет на взаимодействие и расщепление этого компонента протеазным фактором I системы комплемента. Это свидетельствует о том, что Пр5, обладающий высоким сродством к фосфолипидам, может участвовать также и в локальной регуляции воспалительного процесса.

СИСТЕМА ПРОТЕИНА С В РЕГУЛЯЦИИ

Факторы 1Ха и Ха в составе протромбиназного и теназного комплексов на поверхности фосфолипидов частично защищены от действия антитромбина III, во-первых, из-за препятствий, создаваемых компонентами комплексов. Кроме того, антитромбин III активируется на поверхности неповрежденных эндотелиальных клеток, а активированные факторы свертывания образуются на фрагментах мембран клеток или тромбоцитах, т. е. пространственно разобщены. Когда тромбин вымывается потоком крови из места образования и контактирует с неповрежденным эндотелием, то он может либо инактивироваться антитромбином III, либо связаться с ТМ и активировать ПрС. Последний, действуя каталитически, расщепляет активированные формы факторов V и VIII, что приводит к распаду комплексов и подавлению свертывания, а свободные формы факторов 1Ха и Ха могут ингибироваться антитромбином III при контакте с эндотелием (рис. 2.8).

Функция системы ПрС, по-видимому, не ограничивается только остановкой процесса свертывания крови. Инфузия ПрСа оказывала более выраженное защитное действие по сравнению с другими антикоагулянтами на выживаемость обезьян при экс-

Рис.

периментальном ДВС. В экспериментах т УИГО показано, что ПрСа может снижать экспрессию молекул адгезии и синтез цитокинов макрофагами.

Инактивация протеина С

11/2 ПрСа в кровотоке составляет около 10 мин, что обусловлено значительно меньшей по сравнению с другими про- теазами скоростью его инактивации белковыми ингибиторами плазмы. По кинетическим параметрам наиболее эффективные ингибиторы ПрСа относят к семейству серпинов: ингибитор ПрС, оц -антитрипсин и протеазный нексин-1. Константы скорости инактивации ПрСа этими ингибиторами на 2-3 порядка ниже, чем тромбина. Гепарин увеличивает скорость инактивации ПрСа в 20-40 раз, что также значительно меньше, чем увеличение скорости инактивации тромбина. Наличие четко выраженного оптимума концентрации гепарина свидетельствует о том, что он выполняет роль матрицы, на которой происходит взаимодействие ПрСа с ингибитором.

Кроме перечисленных выше ингибиторов в инактивации ПрСа в плазме могут принимать участие осг-антиплазмин и аг-макроглобулин, а также ИПТФ в присутствии гепарина. Наличие конкуренции между фактором Ха и ПрСа за взаимодействие с ИПТФ свидетельствует о том, что инактивация ПрСа обеспечивается вторым ингибиторным доменом ИПТФ.

Наследственный и приобретенный дефицит

Дефицит ПрС или Пр5, как и дефицит антитромбина III, — факторы, предрасполагающие к развитию венозных тромбозов и тромбоэмболий. При гетерозиготной форме дефицита тромбозы редко проявляются в возрасте до 14 лет, но вероятность их развития значительно увеличивается с возрастом и при наличии других осложняющих факторов, таких, как травмы, операции и иммобилизация больного, беременность и использование перо- ральных контрацептивов. Значительных отличий в клинической картине тромбозов при дефиците антитромбина III, ПрС или Пр5 не обнаружено, за исключением несколько более высокой вероятности тромбофлебитов при дефиците ПрС/Пр5 и тромбозов при беременности и приеме пероральных контрацептивов у носителей с дефицитом антитромбина III.

Частота гетерозиготного дефицита ПрС в популяции может составлять 1 случай на 300 человек. У больных с семейными тромбозами частота выявления дефицита ПрС или Пр5 составляет 2-5%. Классификация врожденного дефицита ПрС включает 2, а Пр5 — 3 типа. Чаще всего отмечают тип I дефицита, при котором наблюдают параллельное снижение функциональной активности и концентрации этих белков. Тип II дефицита характеризуется более выраженным снижением функциональной активности по сравнению с концентрацией этих белков. К типу III дефицита Пр5 относят случаи, когда снижено содержание свободной формы белка при близком к норме содержании общего Пр5. Всего к настоящему моменту охарактеризовано около 30 нуклеотидных замен в ДНК, кодирующей ПрС. В большинстве случаев это происходит в результате превращения 5-метил- цитозина в тимин вследствие дезаминирования в нуклеотидной паре СрО. Сложная организация гена Пр5 (длина более 80 тысяч пар оснований, 15 экзонов, 14 интронов и наличие псевдогена) ограничивает возможности исследования; молекулярные основы дефицита Пр5 установлены лишь у нескольких больных.

Изменение соотношения между свободной и связанной с С4Ь-СБ формами Пр5 может лежать в основе приобретенного дефицита Пр5 при нефротическом синдроме, когда в результате нарушения процесса реабсорбции белков в проксимальных канальцах нефронов свободный Пр5 выходит в мочу, а высокомолекулярный комплекс Пр5 с С4Ь-СБ не подвергается клубочковой фильтрации. Снижение концентраций Пр5 и ПрС наблюдается при беременности и приеме гормональных контрацептивов, забо-леваниях печени и ДВС. Существуют данные о снижении уровня ПрС при гомоцистеинурии.

Для лечения и профилактики повторных тромбозов у боль-ных с дефицитом ПрС или Пр5 применяют антагонисты витамина К. В начале терапии наблюдают транзиторное состояние гиперкоагуляции, обусловленное более быстрым снижением концентрации ПрС и Пр5, чем витамин К-зависимых факторов свертывания, которое может привести к развитию некроза кожи у больных с исходно сниженным уровнем Пр5 или ПрС. Во избежание этого рекомендуют начинать прием антагонистов витамина К на фоне гепаринотерапии и только после достижения требуемого стабильного уровня антикоагуляции отменять гепарин.

Резистентность и тромбозы

Исследование влияния экзогенного ПрСа на свертываемость т ьИго крови членов семьи с тромбофилией привело к открытию феномена резистентности к ПрСа. Для достижения такой же степени удлинения АЧТВ, как в плазме доноров, к плазме этих больных необходимо было добавить значительно больше

ПрСа- Молекулярный механизм, лежащий в основе обнаруженного феномена, был идентифицирован как замена в факторе V Аг&бОб на СНн- Такая форма фактора V, обладающая нормальной коагулянтной активностью, но устойчивая к расщеплению под действием ПрСа, была названа фактором Улейден-

ПрСа расщепляет 3 пептидные связи в ]М-концевой цепи фактора Уа, причем скорость гидролиза по Аг§[ в положениях 306 и 679 увеличивается после расщепления по Аг^об- Замена Аг§[506 СНп делает невозможным расщепление трипсиноподобной протеазой по этому участку, и в результате инактивация фактора VЛейден под действием ПрСа протекает значительно медленнее, чем нормального.

Замена Аг^ое СНп — наиболее часто встречающаяся (но не единственная) причина врожденной резистентности к ПрСа. В экзоне 13 гена фактора V обнаружены полиморфные участки, которые могут быть связаны с резистентностью к ПрСа.

Резистентность к ПрСа обнаруживают у 10-20% больных, страдающих тромбозом глубоких вен. При селективном анализе семейных венозных тромбозов частота выявления резистентности достигает 50%, а при тромбозах, связанных с беременностью, может доходить до 60%, что в 10 раз выше, чем суммарная ча-стота выявления молекулярных дефектов антитромбина III, ПрС и Пр5 при этой патологии. В популяции частота гетерозиготных носителей фактора Улейден составляет 3-5%, а при обследовании 50 больных с резистентностью к ПрСа гомозиготная форма выявлена у 6 из 47 носителей. Эти данные свидетельствуют о том, что замена Аг^ое на СНп в факторе V — наиболее часто встречающийся генетический дефект, связанный с заболеванием. Однако статистический анализ связи данной мутации с тромбозами показал, что этот дефект рег зе менее значим, чем дефекты других компонентов системы противосвертывания.

Риск развития венозных тромбозов у больных с резистентностью к ПрСа многократно возрастает при наличии других предрасполагающих факторов, таких, как дефицит компонентов противосвертывающей системы, травма, операция, беременность и использование пероральных контрацептивов. Перораль- ные контрацептивы рег зе могут вызывать феномен резистентности к ПрСа, сравнимый по величине с гетерозиготным дефектом

в факторе V. У женщин фактор Улейден — также и фактор риска инфаркта миокарда в молодом возрасте. Риск инфаркта миокарда значительно возрастет при сочетании фактора Улейден с метаболическими нарушениями. Наиболее значимым следует считать сочетание мутации и курения, при котором отмечали 30-50-кратное увеличение риска инфаркта миокарда.

Чувствительность фактора Уа к протеолизу под действием ПрСа может изменяться также в результате посттрансляцион- ных модификаций. 1п ьИго показано, что скорость инактивации фактора Уа под действием ПрСа увеличивается после дегли- козилирования или фосфорилирования тромбоцитарной казеин- киназой-П. Феномен резистентности к ПрСа может развиться в результате повышения в плазме концентрации фактора VIII — другого субстрата ПрСа, способного конкурентно снижать скорость протеолиза фактора Уа комплексом ПрСа-Пр5. К числу наиболее часто встречающихся причин приобретенной рези-стентности к ПрСа могут быть отнесены нарушения иммунной системы.

АНТИФОСФОЛИПИДНЫЙ СИНДРОМ

Еще в начале 50-х годов было обнаружено, что у больных системной красной волчанкой появляется ингибитор свертывания крови, который впоследствии был назван волчаночным антикоа-гулянтом. Установлению природы ингибитора способствовало выявление нормализации свертываемости крови после добавления избытка фосфолипидов, а не нормальной плазмы, как в случае гемофилии. Методом радиоиммунного анализа было показано, что развитие тромбозов у больных системной красной волчанкой связано с появлением в плазме АТ, взаимодействующих с кардиолипином, и волчаночный антикоагулянт был первоначально идентифицирован как АТ к фосфолипидам. Широкое использование высокочувствительных методов анализа показало, что АТ к фосфолипидам появляются при многих заболеваниях и могут быть вызваны также приемом лекарств и неблагоприятными экологическими факторами. Это привело к внедрению термина «антикардиолипиновый», а затем «антифосфолипидный синдром».

АТ могут быть представлены иммуноглобулинами классов О, М или А и проявлять различные свойства как клинически, так и при исследованиях с использованием разных тест-систем. Например, было отмечено, что тромбозы более характерны для аутоиммунных, чем для инфекционных заболеваний, а применение колонки с фосфолипидами позволило разделить АТ к кар- диолипину и волчаночный антикоагулянт. Такое разнообразие АТ следовало ожидать, если бы в роли Аг выступали только фосфолипиды, и вскоре выявили, что в действительности АТ образуются к белок-фосфолипидным комплексам. Наиболее частый Аг для образования антикардиолипиновых АТ — комплекс Р2-гликопротеин I (апоЛП Н) с анионными фосфолипидами, а для волчаночного антикоагулянта — протромбин-фосфолипид- ный комплекс. У больных с антифосфолипидным синдромом обнаружены также АТ к аннексину-У, ПрС и Пр5, тромбомо- дулину и гепарину. Эти АТ могут значительно различаться по сродству, влиянию на активность факторов свертывания и \\/2 АТ в кровотоке.

АТ к фосфолипидам могут нарушать следующие мембранза- висимые реакции системы гемостаза: синтез и секрецию вазоактивных соединений; активацию витамин К-зависимых факторов свертывания; активацию ПрС; инактивацию факторов Уа и УШа комплексом ПрСа-Пр5; активацию антитромбина III гликопротеинами эндотелия.

Таким образом, АТ к фосфолипидам были первоначально идентифицированы как антикоагулянт, замедляющий свертывание крови т V^^^о. Однако их способность ингибировать основные реакции системы противосвертывания при наличии прокоа- гулянтного влияния на тромбоциты и эндотелий приводит к тому, что у больных с антифосфолипидным синдромом риск тромбозов значительно выше риска кровотечений.

Клинически антифосфолипидный синдром характеризуется рецидивирующими тромбозами различной локализации. Тромбы могут развиваться в венозной (70%) и артериальной (30%) системах, а также в системе микроциркуляции. В случаях повторных спонтанных выкидышей и внутриутробной гибели плода, причиной которых могут быть тромбозы сосудов плаценты, частота обнаружения АТ к фосфолипидам доходит до 50%. Так, при антифосфолипидном синдроме могут быть выявлены тромбофлебит глубоких вен голени, цереброваскулярные нарушения (синдром Снеддона), обусловленные тромбозом сосудов мозга. Ьлуейо геИсикпз — рисунок на коже, напоминающий кружева или ячейки рыболовной сети, чаще локализованный в области нижних конечностей и обусловленный венулитом. Также возможны легочная гипертензия, синдром Бадда-Киари (сочетание симптомов внутрипеченочной портальной гипертензии, возникающее при нарушении оттока крови из печеночных вен вследствие их тромбоза), инфаркт миокарда, гемолитическая анемия, тромбоцитопения, тромботический неинфекционный эндокардит (чаще с поражением митрального и аортального клапанов), асептические некрозы головок бедренных костей, а также ложнопо-ложительная реакция Вассермана.

СИСТЕМА ФИБРИНОЛИЗА

Образование фибрина выполняет важную защитную функцию, обеспечивая остановку кровотечения в местах повреждения сосудов. После выполнения гемостатической функции и регенерации ткани фибрин должен быть удален для восстановления нормального кровотока. Это осуществляется фибринолитической системой, состоящей из профермента (плазминогена), ферментов, превращающих Пг в сериновую протеазу, и сложной системы ингибиторов, контролирующих как активацию Пг, так и сам процесс лизиса фибрина (рис. 2.9, табл. 2.3).

Кроме удаления внутрисосудистых тромбов компоненты системы фибринолиза участвуют также в разрушении внеклеточного матрикса и могут выполнять важную функцию в регуляции таких процессов, как эмбриогенез, регенерация тканей, рост и метастазирование опухолей.

ПЛАЗМИНОГЕН И ПЛАЗМИН

Фермент, непосредственно расщепляющий фибрин, — плаз- мин (ПЛ), образующийся при активации Пг. Пг синтезируется в печени и секретируется как одноцепочечный белок, состоящий из 790 аминокислотных остатков и содержащий 01и в качестве 1Ч-концевой аминокислоты, но в плазме присутствует в виде

а2-Антиплазмин

Плазмин-а2-антиплазмин

Рис. 2.9. Основные реакции системы фибринолиза. Сплошными стрелками показаны реакции секреции и активации компонентов, пунктирными — их ингибирование. тАП активирует только Пг, связанный с фибрином. Урокиназа может активировать как свободный, так и связанный с фибрином Пг. Богатый гистидином гликопротеин — конкурентный ингибитор связывания Пг с фибрином. Расщепление фибрина до растворимых фрагментов протекает в несколько этапов. После образования Х-фрагментов фибрина в его структуре экспонируются дополнительные участки связывания Пг и тАП, что увеличивает скорость разрушения фибрина. оцу-АП — одноцепочечный активатор Пг урокиназного типа; дцу-АП — двухцепочечная форма активатора Пг урокиназного типа; ИАП — ингибитор активаторов Пг.

Таблица 2.3. Основные компоненты системы фибринолиза Название Молеку-лярная масса, кД Содержание в плазме ^1/2 Функция Пг 90 0,2 мг/мл 50 ч Профермент Тканевый активатор Пг 70 5-10 нг/мл 3-5 мин Активатор Пг Урокиназа 55

31 1 нг/мл 3-5 мин Активатор Пг Прекалликреин 88 0,04 мг/мл 25 ч Профермент Фактор XII 80 0,03 мг/мл 60 ч Профермент «г-Антиплазмин 70 0,07 мг/мл 50 ч Ингибитор

плазмина а2-Макроглобулин 4-160 2,5 мг/мл — Поливалентный

ингибитор Ингибитор активаторов Пг типа 1 50 60 нг/мл 5-7 мин Ингибитор тАП и урокиназы Ингибитор активаторов Пг типа 2 70 < 5 нг/мл — Ингибитор

урокиназы С1-ингибитор 105 0,2 мг/мл — Ингибитор системы комплемента и контактной активации Богатый гистидином гликопротеин 75 0,1 мг/мл Связывание Пг Активируемый

тромбином

ингибитор

фибринолиза 49 2,5 мкг/мл Ингибирование взаимодействия Пг с фибрином

нескольких изоформ. Наличие 2 основных изоформ обусловлено разной степенью гликозилирования. СНи-Пг I содержит 2 угле-водные цепочки, связанные с Азпгвв и ТЬгз45, а СНи-Пг II — только одну, связанную с ТЬгз45. Степень гликозилирования влияет на сродство Пг к остаткам Ьуз, а также на скорость его активации и расщепления плазмином. Плазмин легко рас

щепляет 3 СВЯЗИ — Аг§б7_Ме^68. Еу576~Еу577 ИЛИ Ьу877-Уа178 — в молекуле Пг с высвобождением 1^-концевого полипептида. Образующиеся при этом формы Пг обладают сходными свойствами, и их принято называть Ьуз-Пг независимо от того, какова в действительности 1^-концевая аминокислота. Ьуз-Пг активируется с большей скоростью, чем СНи-Пг, и быстрее вы-водится из кровотока. Различия в скорости активации особенно заметны в отсутствие кофакторов активации, таких, как фибрин или аналоги Ьуз. Эластаза может селективно расщеплять Пг с образованием мини-Пг (Уа^-Пг), не содержащего первых

крингл-доменов.

Третичная структура Пг характеризуется высокой стабильностью, которая обеспечивается 24 дисульфидными мостиками. Большая часть структуры приходится на 5 крингл-доме- нов, содержащих так называемые лизинсвязывающие участки. На крингл-1 находится участок высокого сродства (Кй ~9 мкМ), на остальных — участки низкого сродства (Кй ~5 мМ). Крингл- доменам принадлежит важная функция в связывании Пг с фибрином и мембранами клеток, в активации Пг, а также в обеспечении специфичности и локализации действия плазмина.

Активация Пг происходит в результате расщепления связи Аг§5б1-Уа15б2 с образованием фермента, состоящего из 2 цепей, соединенных 2 дисульфидными мостиками. Активный центр находится в легкой В-цепи (С-концевой фрагмент Пг) и представлен остатками Н18б02> Азрмб и $ег740- Легкая цепь — малоспецифическая трипсиноподобная протеаза, способная расщеплять практически все белки плазмы. Специфичность действия плазмина обеспечивается крингл-доменами тяжелой А-цепи (1^-кон- цевой фрагмент Пг).

ИНГИБИТОРЫ ЛИЗИСА ФИБРИНА

аг-Антиплазмин (аг-АП) принадлежит к семейству серпи- нов. Молярная концентрация аг-АП в плазме в 2 раза ниже, чем концентрация Пг. аг-АП синтезируется в печени и секретируется как одноцепочечный гликопротеин, состоящий из 464 аминокислотных остатков. В крови аг-АП присутствует в виде 2 форм: Ме1-аг-АП и Азп-аг-АП. Азп-аг-АП образуется в результате отщепления 12-членного пептида от Ы-конца Ме1>а2-АП. Обе формы а2-АП ингибируют плазмин в растворе с одинаковой скоростью, но Ме1-с12-АП обладает меньшим сродством к фибрину, чем Азп-аг-АП.

сх2-АП ингибирует свободный плазмин с очень высокой скоростью (1^2 0,1-0,5 с). Реакция протекает в две стадии.

Вначале быстро образуется обратимый комплекс а2-АП-плаз- мин (Кс1~2- 10“10 М), в котором затем происходит медленное расщепление аг-АП по реактивному центру Аг^354-Ме1:з55. С-концевой фрагмент аг-АП остается нековалентно связанным с крингл-1, а Ы-концевая часть образует ковалентную связь с 5ег активного центра плазмина. Взаимодействие аг-АП с суб- стратсвязывающим участком обеспечивает селективность действия плазмина. В присутствии быстродействующего ингибитора этот фермент может проявлять свою активность только в месте образования до тех пор, пока остается связанным с фибрином.

Кроме ингибирования плазмина в кровотоке аг-АП принадлежит важная роль в стабилизации фибрина. При полимеризации в фибрин включаются как Пг, так и ссд-АП в примерно равном количестве. Причем аг-АП связывается, а затем и сшивается фактором ХШа с С-концевой областью а-цепи фибрина, которая в первую очередь расщепляется под действием плазмина. Сшитый с фибрином а2-АП инактивирует плазмин, образовавшийся из связанного при полимеризации Пг, после расщепления С-концевой области а-цепи фибрина, которое еще не приводит к распаду полимера, но открывает новые участки связывания с высоким сродством Пг к тАП. Расщепление фибрина до растворимых фрагментов происходит после активации Пг, связывающегося с частично разрушенным фибрином. Наличие двух стадий в лизисе фибрина — один из механизмов, обеспечивающих смещение во времени процессов образования и лизиса фибрина. Кроме этого, тот факт, что растворение фибрина происходит путем связывания с ним Пг из кровотока, обеспечивает протекание лизиса с поверхности тромба, тем самым предотвращая образование эмболов.

аг-Макроглобулин (а2-МГ) — полифункциональный ингибитор протеаз. Это гликопротеин с молекулярной массой 725 кД, состоящий из 4 идентичных субъединиц. В его структуре имеется последовательность Аг^^-ЛЫ-СПу-РЬе-Туг-СНибеб, пептидные связи которой могут расщепляться многими типами протеаз. расщепление приводит к конформационным изменениям аг-МГ, в результате которых гидролизуется тиоэфирная связь между Су5949и СНП952>а карбонильный радикал образует ковалентную связь с протеазой, но в отличие от серпинов не по активному центру. Поэтому комплекс протеаза-аг-МГ сохраняет способность расщеплять низкомолекулярные субстраты, а взаимодействие с белками становится невозможным из-за препятствий, создаваемых макромолекулой ингибитора. Комплекс протеаза- «2-МГ связывается с рецепторами на фибробластах, макрофагах и клетках РЭС, транспортируется внутрь клеток и расщепляется лизосомальными протеазами.

СХ2-МГ ингибирует плазмин со скоростью, значительно меньшей, чем СИ2-АП, но в плазме молярное соотношение Пг/аг-АП составляет 2 : 1, и аг-МГ может играть важную роль в инактивации плазмина при потреблении аг-АП.

Активируемый тромбином ингибитор фибринолиза. Стимулом к открытию еще одного ингибитора фибринолиза послужило наблюдение зависимости скорости лизиса сгустков плазмы от количества образовавшегося тромбина. Активируемый тромбином ингибитор фибринолиза (АТИФ) был выделен и иден-тифицирован как карбоксипептидаза II (прокарбоксипептиза- за В плазмы), специфически отщепляющая С-концевые остатки Ьуз, которые экспонируются после частичного расщепления фибрина и формируют новые участки связывания тАП и Пг. Это приводит к снижению скорости лизиса фибрина.

Свободный тромбин активирует АТИФ с низкой скоростью, поэтому антифибринолитический эффект этого ингибитора зависит от количества тромбина, образующегося при активации свертывания крови. Компоненты системы ПрС могут оказывать разнонаправленное действие на АТИФ. Активация ПрС и расщепление фактора Уа снижают количество образующегося тромбина, что должно приводить к снижению скорости активации АТИФ. В то же время связывание тромбина с ТМ приводит не только к активации ПрС, но и к 1000-кратному увеличению скорости активации АТИФ комплексом тромбин-ТМ. Результирующая этих двух процессов зависит от многих параметров, определяющих формирование тромба ш ш'да.

Богатый гистидином гликопротеин. К числу ингибиторов фибринолиза может быть отнесен и богатый гистидином гликопротеин (БГГ). Этот белок с молекулярной массой 75 кД присутствует в плазме и тромбоцитах, из которых секретируется при активации. БГГ обладает высоким сродством к лизинсвязы- вающему центру 1 Пг (Кй ~ 1 мкМ) и может служить конкурентным ингибитором взаимодействия Пг с фибрином. В плазме — 50% Пг находится в виде комплекса с БГГ, обладающего низким сродством к фибрину. В то же время БГГ, секретируемый активированными тромбоцитами, связывается с их поверхностью и может выполнять роль буфера, обеспечивающего накопление Пг в области тромбообразования.

РАСЩЕПЛЕНИЕ ФИБРИНОГЕНА И ФИБРИНА ПЛАЗМИНОМ

Плазмин расщепляет пептидные связи фибриногена в определенном порядке с образованием продуктов разрушения, обозначаемых как Х-, V-, О- и Е-фрагменты. Наиболее чувствительна к протеолизу С-концевая часть Аа-цепи, способная расщепляться по остаткам 584, 425 и 207. Затем происходит отщепление Ы-концевого 42-членного пептида В|3-цепи. Фибриноген — симметричная структура, но расщепление по отмеченным остаткам может протекать асимметрично с образованием набора Х-фраг- ментов, имеющих молекулярную массу от 330 до 240 кД. Х-фраг- менты могут полимеризоваться под действием тромбина, хотя и с меньшей скоростью, чем нативный фибриноген.

Полная потеря свертываемости происходит после отщепления одного из О-фрагментов, содержащего периферический участок полимеризации. Далее У-фрагмент может расщепляться на начальные О- и Е-фрагменты, которые после отщепления нескольких коротких пептидов превращаются в конечные фрагменты с молекулярной массой 80 кД (О-фрагмент) и 50 кД (Е-фраг- мент).

Расщепление связей в сшитом фибрине происходит примерно в том же порядке, как и при расщеплении фибриногена, а конечные продукты расщепления — Е-фрагменты и О-димер. О-ди-

Мер состоит из 2 ковалентно связанных О-фрагментов, принадлежавших смежным молекулам фибрин-мономеров в полимере. В плазме растворимые фрагменты фибрина могут представлять собой набор фрагментов, состоящих из О-димера, связанного ковалентно или нековалентно с Е-фрагментами.

АКТИВАТОРЫ ПЛАЗМИНОГЕНА

Тканевый активатор плазминогена (тАП) синтезируется клетками эндотелия и секретируется как одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 70 кД. В препаративных количествах тАП может быть выделен из культуры клеток меланомы.

При хроматографии на Ьуз-сефарозе тАП разделяется на 2 формы — типы I и II, отличающиеся по содержанию углеводов. Участки гликозилирования — Азп в положениях 117, 184 (только при типе I) и 448. С Азпц7 связан линейный олигосахарид, состоящий из остатков маннозы. Два других участка содержат разветвляющиеся до 4 цепочек олигосахариды, содержащие остатки Ы-ацетиллактозамина. Степень гликозилирования тАП влияет на кинетику активации Пг. Удельная активность тАП типа I в ~1,5 раза выше, чем активность тАП типа II.

Третичная структура тАП состоит из пальцевидного домена фибронектина, домена фактора роста эпидермиса, 2 крингл-до- менов и протеазного домена. Домен фибронектина и крингл-2 содержат участки связывания тАП с фибрином. Активный центр образуют остатки Н15322, А5Р371 и 5ег478. Плазмин, калликреин и фактор Ха специфически расщепляют тАП по Аг^275-Не27б с образованием активатора, состоящего из 2 цепочек, соединенных дисульфидным мостиком. Физиологическое значение превращения тАП в двухцепочечную форму неизвестно. В отсутствие фибрина двухцепочечный тАП активирует Пг с несколько большей скоростью, чем одноцепочечный, но в присутствии фибрина активаторные свойства двух форм тАП практически не различаются.

Свободный Пг активируется тАП с очень низкой скоростью. Реакция характеризуется низкой величиной кса( и значением Кт, более чем на порядок превышающим концентрацию Пг в крови. Фибрин связывает тАП и Пг. Образование комплекса фибрин- тАП-Пг на 3 порядка увеличивает каталитическую эффективность активации Пг. В процессе разрушения фибрина плазмином на нем экспонируются новые участки связывания Пг с высоким сродством и наблюдается дальнейшее увеличение скорости активации Пг.

тАП обладает коротким 11/2в кровотоке. Основной орган, обеспечивающий выведение тАП, — печень. При прохождении через печень из крови удаляется 70% активатора. Исследование динамики тАП в крови после внутривенной инфузии показало, что выведение активатора из кровотока характеризуется нали-чием двух фаз с !|/2 около 3 и 30 мин. Предполагается, что фаза быстрого снижения концентрации тАП обусловлена его клиренсом клетками печени и обратимым связыванием с эндотелием, а фаза медленного снижения — поступлением в кровь активатора, депонированного ранее на эндотелии.

Несколько типов рецепторов могут участвовать в связывании и интернализации тАП. В печени эндотелиальные клетки и клетки Купфера связывают преимущественно свободную форму тАП и взаимодействие с их рецепторами обеспечивается остатками маннозы углеводной цепи, связанной с Азпц7 первого крингл- домена. Клетки паренхимы содержат Са2+-зависимый рецептор, взаимодействующий с ЕОР-доменом тАП. Рекомбинантные формы тАП, в которых удалены 3 14-концевых домена или изменено положение участка гликозилирования, выводятся из кровотока в несколько раз медленнее, чем природная форма тАП.

Гепатоциты содержат рецептор, гомологичный рецептору ли- попротеинов низкой плотности, который связывает как свободный тАП, так и его комплекс с ингибитором. Этот рецептор участвует в связывании и интернализации также и других протеаз, инактивированных аг-МГ. Он состоит из 2 полипептид- ных цепей с молекулярной массой 515 и 85 кД. С рецептором взаимодействует еще один белок, имеющий молекулярную массу 39 кД. Лигандсвязывающие участки находятся на субъединице с молекулярной массой 515 кД, располагающейся на поверхности клеток и взаимодействующей с субъединицей с молекулярной массой 85 кД, обладающей трансмембранным и цитоплазматическим доменами. тАП и комплекс тАП-ИАП-1 связываются, по-видимому, с разными участками рецептора, так как белок с молекулярной массой 39 кД ингибирует в большей степени связывание комплекса, чем свободного тАП.

Многие типы клеток специфически связывают Пг со сродством ~ 1 мкМ. Рецепторы тАП на мембранах клеток, а также такие белки межклеточного матрикса, как тромбоспондин, желатин и коллаген IV типа могут стимулировать активацию связанного с мембранами Пг под действием тАП, но их кофакторная активность значительно меньше, чем у фибрина.

Урокиназа. Трипсиноподобная протеаза, активирующая Пг, впервые была выделена из мочи и названа урокиназой. Выделенный фермент состоял из 2 субъединиц, соединенных дисульфид- ным мостиком. Вскоре было показано, что клетки секретируют урокиназу в виде одноцепочечного белка, который не расщепляет синтетические субстраты и не взаимодействует с ацилирующими реагентами. Это послужило основанием для названия данной формы фермента проурокиназой.

При инкубации Пг с одноцепочечной урокиназой происходит взаимная активация проферментов. Кинетический анализ показал, что образование двухцепочечной урокиназы и плазмина может быть описано моделью, включающей 3 последовательные реакции: активацию Пг одноцепочечной урокиназой; превращение образующимся плазмином одноцепочечной урокиназы в двухцепочечную; активацию Пг двухцепочечной урокиназой. Связывание Пг с одноцепочечной урокиназой может приводить к конформационным изменениям, в результате которых формируется активный центр, обеспечивающий начальную активацию Пг. В пользу этого свидетельствует то, что способностью активировать Пг обладает рекомбинантная форма активатора, которая в результате замены Ьуз^в 01й не расщепляется плазмином на двухцепочечную. Таким образом, одноцепочечная урокиназа, по-видимому, — не истинный профермент, и Международный комитет по тромбозу и гемостазу рекомендовал заменить термин «проурокиназа» на «одноцепочечный активатор Пг урокиназного типа» (оцу-АП).

оцу-АП секретируется клетками как белок с молекулярной Массой 54 кД, состоящий из 411 аминокислотных остатков. Вторичная структура состоит из 3 участков, включающих крингл- и каталитический домен. Активный центр образуют остатки Н15204, Азр255 И 5еГ356.

Ряд связей в структуре оцу-АП легко подвергается протео- лизу, что обусловливает наличие нескольких изоформ фермента. Из культуры клеток аденокарциномы человека выделена низкомолекулярная (32 кД) форма, которая может образоваться в результате расщепления связи СНи^з-Ьеи^. По ферментативным свойствам эта форма практически не отличается от нативного оцу-АП. Плазмин и калликреин расщепляют связь Ьуз^-Не^д с образованием двухцепочечной формы фермента (дцу-АП), в котором легкая (1М-концевая) и тяжелая (С-концевая) цепи связаны дисульфидным мостиком. Плазмин может далее расщеплять и связь Ьуз 135—Ьу^ 136 с образованием низкомолекулярной формы (33 кД), не содержащей регуляторных доменов. В коммерческих препаратах дцу-АП обнаружена форма, которая может образоваться также в результате расщепления связи РЬе^-Ьуз^.

Тромбин специфически расщепляет Аг^б-РЬе^ с образованием двухцепочечной формы, не активирующей Пг т ш'/го, но обладающей заметной тромболитической активностью т шдо. Плазмин может, хотя и с очень низкой скоростью, расщеплять в этой форме связь Ьуз^й-Пе^э с образованием активного дцу-АП.

Ы-концевая аминокислота тяжелой цепи имеет важное значе-ние в проявлении протеолитической активности дцу-АП. Добавление аминокислот с Ы-конца или даже консервативная замена Пе159 приводит к резкому снижению способности дцу-АП акти-вировать Пг. Предполагается, что этот остаток после расщепления связи Ьуз^е—Не159 перемещается в область субстратсвязы- вающего центра и принимает участие в его формировании.

оцу-АП не обладает высоким сродством к фибрину, но при внутривенном введении вызывает лизис тромбов без выраженной активации Пг в кровотоке. Селективность действия оцу-АП может быть обусловлена: образованием в плазме обратимого комплекса с ингибитором, диссоциирующего при взаимодействии оцу-АП с Пг, связанным с фибрином; локальной активацией оцу-АП на поверхности тромба калликреином, фактором ХПа или плазмином; включением в тромб ряда белков плазмы и клеток крови, взаимодействие которых может приводить к форми

рованию уникальной структуры, обеспечивающей высокое сродство к оцу-АП и увеличение его активности даже без превращения в дцу-АП. Подтверждением этой точки зрения может слу-жить то, что резистентный к расщеплению плазмином оцу-АП и форма, расщепленная тромбином, обладают намного большей активностью в лизисе тромбов, чем можно было бы ожидать, исходя из кинетики активации Пг т ь'йго.

Урокиназа синтезируется различными типами клеток: фиб- робластами, эпителиальными клетками, пневмоцитами, децидуальными клетками плаценты, макрофагами, а также эндотелиальными клетками под воздействием различных стимулов. Многие типы клеток обладают специфическим рецептором к уро- киназе (у-АПР). у-АПР — богатый цистеином гликопротеин, не имеющий трансмембранного и внутриклеточного доменов. Взаимодействие с мембраной клетки обеспечивается ковалентной связью С-конца с гликозилфосфатидилинозитолом. Связывание урокиназы с у-АПР обеспечивается Ы-концевым ЕОЕ-доменом и характеризуется высоким сродством (К^ ~ Ю~9-Ю~10 М) и специфичностью. Другие ЕОР-содержащие компоненты системы гемостаза с этим рецептором не взаимодействуют. Связывание урокиназы с у-АПР активирует сигналпроводящую систему, дифференциацию клеток, хемотаксис нейтрофилов и миграцию клеток эндотелия. Связанная с рецептором урокиназа активирует Пг и латентные металлопротеазы в межклеточном пространстве, что обеспечивает разрушение внеклеточного матрикса, необходимое для роста, деления и миграции клеток. Повышенное содержание урокиназы, ее рецепторов и ИАП-1 в клетках опухолей ассоциируется с ростом и метастазированием опухолей и плохим прогнозом заболевания.

ИНГИБИТОРЫ АКТИВАТОРОВ ПЛАЗМИНОГЕНА

тАП непрерывно секретируется эндотелием как активный фермент, но в крови он быстро инактивируется. Наиболее эффективный ингибитор тАП и урокиназы — белок из семейства серпинов, получивший название ингибитора активаторов Пг типа 1 (ИАП-1). Ингибитор активаторов Пг типа 2 (ИАП-2), инактивирующий с высокой скоростью урокиназу, синтезируется плацентой, моноцитами и макрофагами. В норме в крови он не обнаруживается, но при беременности и ряде заболеваний его со-держание в плазме может значительно возрастать. Ингибиторы, первоначально описанные как ИАП-3 и ИАП-4, впоследствии были идентифицированы как ингибитор ПрСа и протеазный нек- син-1 соответственно.

ИАП-1 — гликопротеин с молекулярной массой 52 кД, состоящий из 379 аминокислотных остатков. Основное место синтеза ИАП-1 — эндотелий сосудов. ИАП-1 может синтезироваться также гепатоцитами, моноцитами, фибробластами, клетками меланомы и ГМК. Значительное количество ИАП-1 (~90% от общего пула крови) содержится в а-гранулах тромбоцитов и секретируется из них при активации, что может создавать высокую локальную концентрацию ИАП-1 и играть важную роль в стабилизации фибриновой матрицы тромба.

ИАП-1 может находиться в активной и латентной формах, переход между которыми не связан с протеолизом и обратим. 1п V^^^о латентный ИАП-1 активируется обработкой хаотропны- ми реагентами. Физиологический механизм активации латентного ИАП-1 неизвестен. Предполагается, что негативно заряженные фосфолипиды, экспонирующиеся на поверхности активированных тромбоцитов, могут активировать латентный ИАП-1. В плазме активная форма ИАП-1 связывается с витронектином, стабилизирующим активную конформацию ИАП-1. Витронектин обеспечивает также связывание ИАП-1 с внеклеточным матриксом.

Взаимодействие ИАП-1 с активаторами протекает в две стадии. Вначале быстро (кса1 ~ 107 М-1 • с~!) образуется обратимый комплекс, в котором происходит расщепление связи Аг§з4б-Ме1з47 реактивного центра с освобождением С-концево- го пептида ингибитора и образованием ковалентного комплекса активатор-ИАП-1. Комплекс тАП-ИАП-1 может связываться с фибрином и быть конкурентным ингибитором взаимодействия тАП с фибрином.

Повышение активности ИАП-1 — наиболее часто встречаю-щаяся причина снижения фибринолитической активности крови. Анализ соотношения между содержанием в плазме тАП, его активностью и активностью ИАП-1 показал, что доля активного тАП экспоненциально снижается при линейном увеличении активности ИАП-1. При активности ИАП-1 менее 7 МЕ/мл около 33% секретируемого эндотелием тАП находится в активном состоянии, а при активности ИАП-1 более 22 МЕ/мл на долю активного тАП приходится лишь 1,5%. Прямое доказательство того, что повышение ИАП-1 может приводить к патологическому тромбообразованию, получено в экспериментах с трансгенными мышами, у которых венозные тромбозы развивались при повышении экспрессии гена ИАП-1 и исчезали после ее подавления. Гетерозиготная форма врожденного дефицита ИАП-1 протекает бессимптомно, а у гомозигот наблюдаются медленное заживление ран и повышенная кровоточивость после травм.

В промоторном участке гена ИАП-1 обнаружен 40/50- полиморфизм, который влияет на скорость транскрипции. В популяции встречаемость генотипов 40/40, 40/50 и 50/50 соответствует 0,25, 0,5 и 0,25. Уровень ИАП-1 в плазме у 40/40- гомозигот на ~30% выше, чем у 50/50. Активность ИАП-1 в плазме подвержена циркадным изменениям в течение дня с мак-симумом в утренние часы и в течение года с максимумом в зимние месяцы. ИАП-1 — один из компонентов системы гемостаза, определяющих утреннюю гиперкоагуляцию.

ИАП-1 — один из наиболее быстрореагирующих белков острой фазы. Его активность в плазме может значительно повышаться при многих заболеваниях. Синтез ИАП-1 стимулируется эндотоксином, цитокинами, факторами роста, а также тромбином, тАП и ангиотензином II.

Данные проспективных исследований свидетельствуют о том, что повышение активности ИАП-1 и/или снижение активности тАП связано с риском развития инфаркта миокарда у больных с нестабильной стенокардией, повторного инфаркта миокарда в молодом возрасте и рестенозов после ангиопластики. В то же время необходимо отметить, что при многофакторном анализе значимость ИАП-1 как фактора риска снижается, что отражает его взаимосвязь с другими факторами риска заболеваний ССС. Уровень ИАП-1 в плазме коррелирует с концентрацией инсулина, индексом массы тела, повышением уровня ТГ и снижением содержания ЛПВП, которые характерны для синдрома резистент-ности к инсулину.

следовании факторов риска атеросклероза повышение соотношения тАП и Аг ассоциировалось с появлением его ранних признаков.

В ряде исследований были обнаружены повышение уровня Аг и тАП у больных с тромбозами и наличие отрицательной корреляции между концентрацией Аг и активностью тАП в плазме больных. Предполагается, что повышение уровня Аг и тАП может быть обусловлено увеличением скорости ингибирования тАП в кровотоке и накоплением комплекса тАП-ИАП-1, клиренс которого клетками печени осуществляется медленнее, чем свободного тАП.

СТРЕПТОКИНАЗА

В 1933 г. было обнаружено, что культура р-гемолитического стрептококка продуцирует соединение, вызывающее лизис сгустков крови. Это соединение получило первоначальное название «фибринолизин». Впоследствии оказалось, что для лизиса фибрина под действием стрептококков необходим еще и плазменный фактор. Этот фактор был назван Пг, а фибринолизин переименован в стрептокиназу (СК). В конце 50-х годов были получены высокоочищенные препараты СК и началось ее применение для растворения внутрисосудистых тромбов, открывшее эру тромбо- лизиса.

СК — одноцепочечный белок с молекулярной массой 47 кД и состоящий из 386 аминокислотных остатков. СК не имеет собственной ферментативной активности , а ее эффективность как стимулятора фибринолиза значительно варьирует у животных разных видов. Механизм стимуляции фибринолиза в плазме человека заключается в образовании с высокой скоростью (ка55 ~ 105 М-1с-1) стехиометрического комплекса СК- Пг (Кй~ 109 М-1), в котором в результате конформационных изменений в Пг формируется активный центр протеазы. Фермен-тативные свойства комплекса СК-Пг существенно отличаются от таковых плазмина: комплекс служит активатором Пг, а плаз-

следовании факторов риска атеросклероза повышение соотношения тАП и Аг ассоциировалось с появлением его ранних признаков.

В ряде исследований были обнаружены повышение уровня Аг и тАП у больных с тромбозами и наличие отрицательной корреляции между концентрацией Аг и активностью тАП в плазме больных. Предполагается, что повышение уровня Аг и тАП может быть обусловлено увеличением скорости ингибирования тАП в кровотоке и накоплением комплекса тАП-ИАП-1, клиренс которого клетками печени осуществляется медленнее, чем свободного тАП.

СТРЕПТОКИНАЗА

В 1933 г. было обнаружено, что культура р-гемолитического стрептококка продуцирует соединение, вызывающее лизис сгустков крови. Это соединение получило первоначальное название «фибринолизин». Впоследствии оказалось, что для лизиса фибрина под действием стрептококков необходим еще и плазменный фактор. Этот фактор был назван Пг, а фибринолизин переименован в стрептокиназу (СК). В конце 50-х годов были получены высокоочищенные препараты СК и началось ее применение для растворения внутрисосудистых тромбов, открывшее эру тромбо- лизиса.

СК — одноцепочечный белок с молекулярной массой 47 кД и состоящий из 386 аминокислотных остатков. СК не имеет собственной ферментативной активности*, а ее эффективность как стимулятора фибринолиза значительно варьирует у животных разных видов. Механизм стимуляции фибринолиза в плазме человека заключается в образовании с высокой скоростью (ка55 ~ 105 М-1с-1) стехиометрического комплекса СК- Пг (Кй~ 109 М”1), в котором в результате конформационных изменений в Пг формируется активный центр протеазы. Фермен-тативные свойства комплекса СК-Пг существенно отличаются от таковых плазмина: комплекс служит активатором Пг, а плаз- мин — нет; комплекс СК-Пг инактивируется осг-АП и аг-МГ с очень низкой скоростью; комплекс СК-Пг не обладает способностью прямо расщеплять фибрин. После образования комплекса СК-Пг в нем происходит расщепление как Пг с образованием Ьуз-Пг и плазмина, так и укороченных форм СК:

СК + Пг ^ СК-Пг -> СК-Пг -» СК-Пл -> СК-Пл.

Все эти комплексы обладают способностью активировать Пг, однако по мере накопления расщепленных форм снижается потенцирующее влияние фибрина на активацию Пг и увеличивается скорость инактивации ингибиторами плазмы.

Повышения тромболитической эффективности СК удалось достичь путем создания препаратов (АР5АС, Еттазе), представляющих собой эквимолярные комплексы СК-Пг/Пл, в которых 5ег активного центра протеазы ацилирован. Эта модификация не влияет на структуру крингл-доменов Пг, и ацилирован- ный комплекс связывается с достаточно высоким сродством (Кй~10 мкМ) с фибрином. Скорость деацилирования определяется химической структурой ацила и для р-анизоиловых производных \\/2 составляет ~ 100 мин. Фармакокинетические исследования показали, что \\/2 АР5АС в кровотоке больше, чем СК, и составляет ~90 мин. Большее \\/2 и наличие сродства к фибрину способствуют накоплению активатора в области тромба, а относительно медленное восстановление ферментативной активности позволяет применять болюсное введение препарата больным.