Исследование функциональной активности тромбоцитов в цельной крови

Определение функциональной активности тромбоцитов представляет собой достаточно сложную задачу: с одной стороны, нужно в максимальной

степени сохранить интактное состояние пластинок до начала исследования, а с другой - создать стандартные оптимальные условия, необходимые для обеспечения полной реализации их функций после стимулирования т уйго.

• кровяные пластинки подвергаются значительным механическим воз­действиям, которые могут существенно изменить их функциональную активность и привести к потере наиболее крупных и активных клеток;

• нарушается естественное окружение тромбоцитов, что не позволяет учитывать влияние на них других форменных элементов крови, спе­цифически модулирующих функции кровяных пластинок; значительно увеличиваются время и объём крови, необходимые для подготовки пробы к исследованию;

• увеличивается вероятность значительного изменения концентрации лабильных медиаторов в пробе к моменту измерения. Кроме того, оптические методы не позволяют исследовать кровь больных с выраженной гиперлипидемией, часто встречающейся в кардиологической практике.

В связи с этим, более корректными представляются методы оценки функциональной активности тромбоцитов, позволяющие проводить ис­следования непосредственно в цельной крови. Самыми простыми из них являются способы, основанные на регистрации убыли одиночных тром­боцитов в условиях перемешивания крови с каким-либо агрегантом. Су­ществует целый ряд модификаций таких микрометодов, однако сравнительно низкая чувствительность и воспроизводимость препятствуют их широкому распространению в лабораторной практике.

Значительным прогрессом в рассматриваемой области можно считать появление импедансного метода исследования функциональной активности кровяных пластинок. Импедансный метод определения индуцированной агрегации кровяных пластинок основан на измерении сопряженных с формированием тромбоцитарных агрегатов изменений комплексного сопротивления между электродами, помещенными в исследуемую пробу крови или богатой тромбоцитами плазмы (БТП). Метод позволяет динамически исследовать поведение тромбоцитов в их естественной среде, что устраняет все перечисленные выше недостатки и ограничения нефелометрических способов и делает его наиболее объективным и перспективным современным средством изучения функционального статуса кровяных пластинок.

На основе импедансного метода в последние годы выпущена серия агрегометров цельной крови для научных и клинико-диагностических ла­бораторий (агрегометры фирмы «Сгопо1од» (США), АИ-300 (Санкт- Петербург). В рассматриваемых приборах электроды датчиков при со­прикосновении с перемешиваемой кровью покрываются сначала тром­боцитами в один слой. Если не добавлять индуктор агрегации, то даль­нейшего взаимодействия между тромбоцитами и электродами не происходит и полное электрическое сопротивление между электродами (импеданс) остается постоянным. При внесении агониста развивается агрегация тромбоцитов, в результате чего наблюдается нарастание тромбоцитов на электродах. Утолщение покрывающего электроды слоя приводит к увеличению импеданса между электродами, последнее отображается (в случае агрегомегра АИ-300) на цифровом табло прибора с дискретностью 3 секунды, а также выводится в виде кривой агрегации на графический матричный индикатор прибора. При наличии самописца или компьютера процесс агрегации регистрируется на диаграммной ленте или экране монитора, соответственно. Измерения ведутся при перемешивании проб со скоростью 1100 об/мин (цельная кровь) и 600 об/мин (БТП) и температурной стабилизации образцов (37° С).

Получение крови для исследования функциональной активности тромбоцитов является крайне важным моментом и его корректное про­ведение в значительной степени влияет на конечные результаты, особенно если речь идёт о клинических исследованиях.

Получать крови следует в одно и то же время суток, поскольку ак­тивность тромбоцитов, как и всей системы гемостаза в целом, обнаруживает выраженные колебания на протяжении суток (суточные биоритмы) с максимумом около 9 часов. Все пациенты не должны получать в течение 10­12 дней до момента исследования препаратов, влияющих на функ­циональную активность тромбоцитов. Забор производится из локтевой вены. Для исследования агрегации тромбоцитов кровь стабилизируется 3,8% раствором цитрата натрия в объемном соотношении: 9 частей крови на 1 часть раствора лимоннокислого натрия. Кровь, не встряхивая, тщательно перемешивают плавно вращая пробирку. В процессе исследования пробы сохраняют при комнатной температуре с соблюдением общепринятых мер предосторожности при работе с клетками крови. Адекватное исследование агрегационной активности тромбоцитов возможно в цельной крови в течение

3 часов от момента забора крови, в БТП - в течение 2 часов после осаждения форменных элементов. Недопустим забор крови после длительного венозного стаза. Получение крови рекомендуется осуществлять либо вообще без наложения жгута или манжеты сфигмоманометра, либо, если это возможно, время венозного застоя не должно превышать 1 минуты. В противном случае выделяемые ише-мизированной сосудистой стенкой биологически активные соединения могут существенно изменять функциональный статус тромбоцитов. Если кровь из вены не набирается сразу после укола, повторные пункции одной и той же вены недопустимы.

Вакуумная методика получения проб крови, используемая в совре­менных одноразовых системах забора, при изучении функционального потенциала кровяных пластинок в достаточной степени унифицирована с рутинным способом отбора при свободном токе крови.

Как в момент получения крови, так и в ходе последующих манипуля­ций допускается контакт крови лишь с несмачиваемыми поверхностями. Для предотвращения контактной активации тромбоцитов необходимо производить силиконирование стеклянных поверхностей.

Индукторами агрегации, наиболее часто используемыми при анализе агрегации тромбоцитов, являются аденозиндифосфат (ЛОР), и коллаген. Кроме того, для проверки функциональных отклонений в действии фактора Виллебранда используется антибиотик ристоцетин/ристомицин. При изучении дефицита пула хранения наиболее полезна арахидоновая кислота, для проверки на максимальное выделение хранимых нуклеотидов - тромбин.

Концентрации агонистов для исследования агрегации в цельной крови следует выбирать на пороговых значениях - т.е. в минимальных значениях, дающих полную агрегационную волну. Обычно анализы образцов проводятся при следующих конечных концентрациях индукторов:

Оптимальное соотношение объёмов индуктора агрегации и пробы составляет 1:9-1:12.

Параметры агрегации тромбоцитов, определяемые при исследовании в общем случае агрегатограммы, получаемые в цельной крови, имеют вид сходный с кривыми агрегации, записанными в богатой тромбоцитами плазме. В связи с этим, их анализ проводится по общепринятым характерным точкам (рис.8).

0 4 * II Т, МИН. Рис.8. Характерные параметры типичной агрегатограммы

В зависимости от условий и задач исследования возможно определение следующих параметров:

А1- интенсивность (амплитуда) первичной агрегации, Ом;

А2 - интенсивность (амплитуда) вторичной волны агрегации, Ом;

А3 - интенсивность (амплитуда) максимальной агрегации, Ом;

Т1 - время начала дезагрегации, мин;

Т2 - время начала вторичной агрегации, мин;

а1, - максимальная скорость первичной агрегации, Ом/мин; а2 - максимальная скорость вторичной агрегации, Ом/мин;

Дополнительно измеряется латентный период.

5- 6 минуте от момента ввода стимулятора, когда уже ясно видны чувствительность к дозе и интенсивность агрегации.

Оценка результатов исследования при подобии, в целом, агрегато- грамм, получаемых в цельной крови на импедансном агрегометре и в богатой тромбоцитами плазме на оптических приборах, в параметрах процесса агрегации в указанных биологических субстратах имеются и существенные различия. Для цельной крови отмечено замедление агрегации, по сравнению с плазмой: время достижения максимальной интенсивности увеличивается до 10-15 минут. При этом наблюдается значимая корреляционная связь между амплитудой и максимальной скоростью агрегации: г=0,96 (р