Глава 7. ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ

Величайшие достижения середины XX века — открытие дискретных единиц наследственности (генов), разработка хромосомной теории наследственности,' развитие биохимической генетики микроорганизмов и установление принципа «один ген — один белок», открытие регуляции активности генов прокариотов Ф.

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА КЛЕТКИ

В составе генома имеются структурные гены, кодирующие определенные* биополимеры (белки или РНК), и регуляторные гены, которые контролируют функцию струк-турных генов. Регуляция происходит с помощью белковых продуктов регуляторных генов — репрессоров, подавляющих активность структурных генов. Регуляторными участками генов, контролирующих транскрипцию, являются усилитель транскрипции (enhancer) и промотор — область, предшествующая структурным генам и определяющая место специфического связывания РНК-полимеразы.

Характерной особенностью генов эукариотической клетки является их мозаичная структура, т. е. прерывистость гена. В составе гена, кодирующего один белок, кодирующие участки прерываются вставочными последовательностями, которые не несут никакой кодирующей информации и не транслируются. Кодирующие участки гена называются экзонами, а вставки — нитронами (рис. 25).

При транскрипции считывается весь ген, включая эк- зоны и интроны. Впоследствии происходит созревание (процессинг) иРНК: из образовавшегося длинного первичного транскрипта удаляются участки, соответствующие интронам, а участки, соответствующие экзонам, «сшиваются». В результате подобной модификации из первичного транскрипта образуется зрелая иРНК. Этот процесс вырезания нитронов и сшивания экзонов называется сплайсингом (от английского слова splice — соединять, сращивать концы каната).

Сплайсинг был впервые описан на модели ДНК-содержащих вирусов животных — SV40 и аденовирусов.

В геноме эукариотов наряду с уникальными содержатся и повторяющиеся гены (гены рибосомных и тРНК и гистонов).

Рис. 25. Строение эукариотического гена и его транскрипция, а—строение эукариотического гена SV40: 1—усилитель транскрипции; 2— промотор; 3— инициация репликации ДНК вируса (origin); 4— интроны; 5—экзоны (кодирующие области гена); 6—терминирующая последовательность ААТААА; стрелка обозначает участок начала транскрипции, б — схема сплайсинга при созревании иРНК: 1 — экзоны, 2— интроны, 3— зрелая иРНК.

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ВИРУСА

Вирусы являются одним из излюбленных объектов молекулярной генетики благодаря простому строению и малой молекулярной массе их геномов, которая в 10® раз меньше массы генома эукариотической клетки. Организация генетического аппарата у ряда вирусов, например у SV40, настолько сходна с таковой генов эукариотической клетки, что получила название минихромосомы. Минихромосома широко используется для изучения организации и репликации ДНК.

Число генов у вирусов значительно варьирует: от 3—4 генов у просто устроенных вирусов (парвовирусы) до 150 генов и больше у сложно устроенных (вирус оспы). Геном вирусов животных является гаплоидным, за исключением ретровирусов, которые имеют диплоидный геном, представленный двумя идентичными молекулами РНК. У вирусов с фрагментарным геномом (вирусы гриппа, реовирусы) каждый фрагмент обычно представляет собой один ген.

Так же, как и геном эукариотической клетки, ДНК- геном ряда вирусов животных имеет мозаичную структуру, при которой смысловые последовательности чередуются с неинформативными последовательностями.

В составе генов ДНК-содержащих вирусов есть регуляторные участки, в том числе промотор, контролирующие функцию структурных генов. Сильными промоторами являются концы многих вирусных ДНК, представляющие собой длинные концевые повторы, сильный промотор имеют гены тимидинкиназы вирусов оспы и герпеса. Эти промоторы используются в генной инженерии для усиления транскрипции изучаемого гена.

СПОСОБЫ УВЕЛИЧЕНИЯ

ИНФОРМАЦИОННОЙ ЕМКОСТИ ВИРУСНОГО ГЕНОМА

В отличие от полицистронных иРНК прокариотов, иРНК эукариотов являются моноцистронными, т. е. реализуется принцип «один ген — одна молекула иРНК — один белок». Однако у некоторых клеточных иРНК и часто у вирусных иРНК этот принцип нарушается, и иРНК может направлять синтез двух белков.

У многих вирусов молекулярная масса синтезирующихся белков превышает теоретически рассчитанную. Этот феномен объясняется наличием у вирусов механизмов, позволяющих получить развернутую генетическую информацию при максимальной экономии генетического Материала; подобные механизмы выработаны в процессе эволюции вирусов как генетических паразитов.

Способами увеличения генетической информации являются: 1) двукратное считывание одной и той же иРНК, но с другого инициирующего кодона; 2) сдвиг рамки трансляции; 3) сплайсинг; 4) транскрипция с перекрывающихся областей ДНК и др.

В составе иРНК обычно встречается несколько инициирующих кодонов. В соответствии с принятой в настоящее время гипотезой «сканирующей модели» [Козак М., 1980] малая рибосомальная субъединица связывается с иРНК около 5'-конца и скользит вниз до встречи с инициирующим кодоном.

Трансляция может происходить без сдвига рамки и со сдвигом рамки. Генетический код является триплетным, это означает, что три нуклеотида, составляющих триплет, или кодон, кодируют одну аминокислоту. В том-случае, если триплеты сохранены и генетический код не изменился, то при трансляции с двух разных инициирующих кодонов будут синтезироваться полипептиды, представляющие собой укороченную копию первого полипептида (трансляция без сдвига рамки).

В том случае, если произошел сдвиг на один или два нуклеотида, образуются новые триплеты (кодоны) и появляется новый генетический код. В этом случае одна мо-лекула иРНК может транслироваться с образованием двух уникальных белков, т. е. таких белков, у которых нет идентичных аминокислотных последовательностей.

Сплайсинг со сдвигом рамки широко используется у ряда вирусов (вирусы гриппа, парамиксовирусы, буньяви- русы, аденовирусы, паповавирусы, парвовирусы и др.). Например, все три иРНК аденоассоциированного вируса образуются при транскрипции одного гена и имеют об?

щий З'-конец; самая короткая иРНК образуется путем сплайсинга и транслируется с образованием трех структурных белков, остальные две иРНК транслируются с образованием неструктурных белков. В результате сплайсинга и сдвига рамки иРНК 7-го и 8-го генов вируса гриппа транслируются с образованием двух белков: полипептидов М, и М2 (продукты 7-го гена) и NSi и NS2(продукты 8-го гена).

Одним из способов экономии генетического материала является нарезание полипептида-предшественника на участки разной длины, в результате чего образуются разные полипептиды с перекрывающимися аминокислотными последовательностями. Подобный механизм нарезания имеет место у аденоассоциированных вирусов и у SV40.

Таким образом, число реальных генов превосходит молекулярную массу генома. Основанный на длине генома расчет числа генов неизменно приведет к ошибочным результатам. Более точные представления о числе генов можно получить путем биохимического и генетического анализов.

В результате перекрывания генов и сдвига рамки трансляции «размываются» границы генов, и понятие «ген» в известном смысле утрачивает первоначальное значение как дискретный фрагмент генома и приобретает скорее функциональное значение.

ОСНОВНЫЕ ПРОЦЕССЫ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ

НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСОВ

Модификации. Модификациями называются не наследуемые (фенотипические) изменения у вирусов, обусловленные клеткой-хозяином. Эти изменения лежат в основе адаптации вируса к новому хозяину и преодоления зависимого от хозяина ограничения. Модификации нуклеиновых кислот вирусов осуществляют клеточные ферменты, ответственные за ограничение (рестрикцию) репродукции вируса.

Мутации. В основе изменчивости вирусов лежат мутации, т. е. изменения состава и последовательностей нуклеотидов вирусного генома. Мутации происходят у всех вирусов, независимо от того, является ли их генетическим аппаратом ДНК или РНК. В результате мутаций отдельные вирионы могут приобретать новые свойства. Дальнейшая судьба таких вирусов зависит от естественного отбора, сохраняющего популяцию, наиболее приспособленную к условиям существования.

Мутации могут иметь разные последствия.

В других случаях мутация является летальной, так как вследствие ее нарушается синтез или функция жизненно важного вирусспецифического белка, например вирусной полимеразы.

В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него, условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (temperature sensitive) — ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножения при повышенных температурах (39—42° С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36—37° С).

По своему механизму мутации могут быть тоже раз-ными. В одних случаях происходит делеция, т. е. выпадение одного или нескольких нуклеотидов, в других случаях происходит встраивание одного или нескольких нуклеотидов, а в некоторых случаях — замена одного нуклеотида другим.

/ Мутации могут быть прямыми и обратными. Прямые мутации меняют фенотип, а обратные мутации — реверсии — его восстанавливают. Возможны истинные реверсии, когда обратная мутация происходит в месте первичного повреждения, и псевдореверсии, если мутация происходит в другом участке дефектного гена (интрагенная супрессия) или в другом гене (экстрагенная супрессия). Реверсия не является редким событием, так как ревертанты обычно более приспособлены к данной клеточной системе. Поэтому при получении мутантов с заданными свойствами, например вакцинных штаммов, приходится считаться с возможной их реверсией к дикому типу.

Мутации носят случайный характер и объясняются статистическими законами.

В качестве физических мутагенов наиболее часто применяется ультрафиолетовое облучение, так как его энергия ^ сопоставима с энергией химических связей. Реже применяются более жесткие виды облучения — рентгеновское и у-облучение, а также обработка вирусных суспензий нейтронами, протонами, электронами и ядрами гелия, так как они вызывают сильные разрушения вирусных геномов и их инактивацию.

В качестве химических мутагенов применяют аналоги оснований (бромурацил, бромдезоксиуридин, 2-аминопу- рин, нитрозогуанидин и пр.), алкилирующие и флуоресцирующие соединения (профлавин), интеркалирующие агенты (актиномицин, этидий бромид), азотистую кислоту, гидроксиламин и многие другие.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И НЕГЕНЕТИЧЕСКИЕ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ ВИРУСАМИ

Как в естественных, так и в экспериментальных условиях одна клетка может быть заражена не одним, а несколькими вирусами. В процессе такой смешанной инфекции могут иметь место различные формы взаимодействия как между вирусными геномами, так и между продуктами генов. При взаимодействии геномов могут наблюдаться такие формы генетических взаимодействий, как множественная реактивация, рекомбинация, пересортировка генов, кросс-реактивация, гетерозиготності». При взаимодействии на уровне продуктов генов могут иметь место негенетические взаимодействия: комплементация, интерференция, фенотипическое смешивание и др.

Множественная реактивация. Вирусная инфекция может возникнуть при заражении клетки несколькими ви- рионами с поврежденными геномами вследствие того, что функцию поврежденного гена может выполнять вирус, у которого этот ген не поврежден. Этот феномен был вначале обнаружен на бактериофагах и получил название множественной реактивации. В основе множественной реактивации лежит кооперативный процесс, при котором вирионы с поражением разных генов дополняют друг друга путем генетической рекомбинации, в результате чего репродуцируется исходный неповрежденный вирус.

•Эффективность множественности реактивации зависит от многих причин: степени повреждения генома вирионов, числа проникших в клетку вирионов, концентраций их в определенных участках клетки, аутоинтерференции

поврежденных вирионов. Для множественной реактивации важное значение имеет расстояние между вирионами с поврежденными геномами внутри клетки. Обработка вирионов двухвалентными ионами металлов, ведущая к их агрегации, усиливает множественную реактивацию.

Рекомбинация. Генетической рекомбинацией называют обмен генетическим материалом, происходящий между родительскими вирусами. Возможен обмен полными генами (межгенная рекомбинация), так и участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). Образующийся вирус-рекомбинант обладает свойствами, унаследованными от разных родителей.

Обычно рекомбинируемые штаммы обладают характерными признаками, которые обозначаются как маркеры. Например, были получены рекомбинанты между вирусами полиомиелита, обладающие повышенной устойчивостью и повышенной чувствительностью к гуанидину, разной нейровирулентностью, разной устойчивостью к повышенной температуре, разной чувствительностью к ингибиторам сывороток лошадей и коров и т. п. Для получения рекомбинантов используют штаммы, содержащие два или большее число маркеров.

Тест рекомбинации применяют для генетических исследований вирусов. С его помощью возможно построение генетических карт вирусов, в которых определяется, в каких участках генома произошли мутации, а также в условных единицах измеряется расстояние между разными мутациями.

Пересортировка генов. Вариантом рекомбинации является феномен, получивший название пересортировки генов. Она наблюдается при генетических взаимодействиях между вирусами, имеющими сегментированный геном. Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называют реассортантами. Реассортанты вирусов гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными генами гемагглютинина и нейраминидазы. В этом случае из общего потомства путем нейтрализации соответствующих антигенов можно выделить интересующие исследователя варианты.

Существуют определенные группировки (констелляции или созвездия) генов, которые в данной системе клеток более стойки и делают вирус более жизнеспособным.

Сходные процессы пересортировки генов имеют место у вирусов гриппа типов А, В и С и у других вирусов с фрагментарным геном — у буньявирусов, аренавирусов (однонитчатые РНК) и реовирусов (ротавирусов) (двунитчатая РНК). Однако эти процессы не столь интенсивны и доступны изучению, как у вирусов гриппа.

Перекрестная реактивация. Перекрестная реактивация, кросс-реактивация или реактивация при скрещивании, происходит в том случае, когда у одного из штаммов вируса часть генома повреждена, а другой геном интактен. При смешанной инфекции двумя такими вирусами возможна рекомбинация неповрежденных участков генома инактивированного вируса с геномом интактного вируса, и в результате этого процесса появляются штаммы вируса со свойствами обоих родителей. Описываемый феномен также обозначается как «спасение маркера», поскольку реактивируется (рекомбинирует) лишь часть генома инактивированного вируса, несущая какой-нибудь признак (маркер).

Гетерозиготность. При совместном культивировании двух штаммов вируса может происходить формирование вирионов, содержащих в своем составе два разных генома или по крайней мере один полный геном и часть второго генома. Это явление названо гетерозиготностью.

Комплементация. Комплементация (дополнение) является таким видом негенетического взаимодействия при смешанной инфекции двумя вирусами, которое стимулирует репродукцию обоих партнеров или одного из них, но не изменяет генотипы вирусов. Принцип комплементации заключается в том, что вирус снабжает партнера недостающими компонентами, обычно белками, структурными или неструктурными.

Комплементация может быть односторонней и двусторонней. Двусторонняя комплементация заключается в репродукции обоих партнеров, каждый из которых не способен к самостоятельной репродукции. При односторонней комплементации один из партнеров обеспечивает другого необходимыми для его репродукции продуктами. Вирус, стимулирующий репродукцию другого вируса, называется «вирус-помощник», а вирус, репродуцирующийся только в присутствии помощника, называется «вирус- сателлит».

Комплементация широко распространена среди вирусов и встречается как между родственными, так и неродственными вирусами. Феномен тесно связан с проблемой дефектности вирусов.

Поскольку в вирусной популяции помимо стандартных обычно присутствуют дефектные неинфекционные вирусные особи, в частности дефектные частицы, утратившие часть генетического материала, комплементация имеет место в инфекционном цикле многих вирусов и заключается в том, что члены популяции снабжают друг друга продуктами генов, которые дефектны у партнеров (негенетическая реактивация). Отличие комплементации от генетической рекомбинации заключается в отсутствии обмена генетическим материалом.

Комплементация встречается и у неродственных вирусов, принадлежащих к разным семействам. Одним из семейств, вирусы которого наиболее часто участвуют в комплементации, является семейство аденовирусов. В одних системах аденовирусы могут действовать как дефектные вирусы, в других — как помощники. Например, в культуре клеток почек макак резусов аденовирусы могут репродуцироваться только в присутствии SV40, который является в данном случае вирусом-помощником. В других системах сами аденовирусы действуют как вирусы-помощники, а вирусом-сателлитом является аденоассоци- ированный вирус, относящийся к семейству парвовирусов. Репродукция этого вируса полностью зависит от компле- ментирующего действия аденовирусов. Вирус гепатита В является помощником для дельта-агента, который по-крывается его наружным белком — HBs-антигеном. Сочетание обоих вирусов обнаружено при наиболее тяжелых формах гепатита.

Возможна не только межцистронная, но и внутрицист- ронная комплементация в том случае, когда один ген кодирует несколько белков.

Фенотипическое смешивание. При совместном культивировании двух вирусов может наблюдаться феномен фенотипического смешивания, когда геном одного вируса бывает заключен в капсид, состоящий частично или полностью из белков другого вируса.

Фенотипическое смешивание наблюдается при смешанной инфекции ^многими вирусами, причем эти вирусы могут быть как близкими друг другу (например, вирусы гриппа А и В или разные серологические подтипы вируса гриппа А), так и весьма далекими (онковирусы и раб до- вирусы) .

Подлинную революїщю в физическом картировании геномов вирусов произвело применение рестриктаз и сек- венирование вирусных геномов. Рестриктазы имеют исключительное значение в молекулярной генетике вообще и генетической инженерии в частности. Их открытие (1968—1970 гг.) впервые дало возможность специфически расщеплять ДНК на строго определенные фрагменты, доступные для препаративного выделения и анализа.

Рестриктазы или эндодезоксирибонуклеазы — это просто организованные белки, являющиеся ферментами, широко распространенными среди прокариотов и участвующими в генетических процессах. В отличие от экзонук- леаз, отщепляющих концевые нуклеотиды или свободные остатки фосфорной кислоты, эндонуклеазы расщепляют молекулу ДНК изнутри, обычно — в местах, где преобладают пиримидиновые основания. Рестриктазы характеризуются высоковыраженной специфичностью, распознавая строго определенные последовательности нуклеотидов в двунитчатой ДНК.

Число новых рестриктаз стремительно нарастает и со временем, по-видимому, будут обнаружены рестриктазы, узнающие любую последовательность нуклеотидов.

Использование разных рестриктаз позволяет получать фрагменты разной величніш, которые затем разделяются и анализируются путем электрофореза в агарозных или полиакриламидных гелях. Сочетание рестрикционного анализа с другими методами позволяет составить физические карты геномов вирусов. Физические карты вирусных геномов обозначают взаимное расположение генов, их границы, локализацию начала репликации, промоторов, лидеров, экзонов и нитронов, сигнальных последовательностей и других генетических элементов.

На рис. 26 приведена физическая карта генома SV40. Границы генов, кодирующих синтез ранних и поздних белков, и направление транскрипции самих генов похазаны стрелками. Из этой схемы видно, что генетический код для синтеза белков этого вируса записан не на одной, а на обеих нитях ДНК и что транскрипция разных генов идет в разных направлениях.

В настоящее время полностью расшифрованы нуклеотидные последовательности отдельных генов и целых геномов методом секвенирования (от англ. sequence — последовательность). Если речь идет о РНК-содержащих

Рис. 26. Структура генома SV40.

Т-ант*ге*

Стрелки указывают направление синтеза и размеры соответствующих генов; зигзагообразные участки — интроны, VP-вйрусный бе-лок.

вирусах, то предварительным условием для дальнейшего их анализа является переписка РНК на ДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскрип- тазы), после чего генетический материал может быть подвергнут рестрикционному анализу.

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

До сих пор речь шла о генетических процессах при взаимодействии биологически (и эволюционно) близких вирусов.

Однако возможны генетические взаимодействия и неродственных вирусов. Эти взаимодействия являются пред-метом изучения генной, или генетической инженерии.

В 1972 г. появилась первая публикация по генной инженерии П. Берга о получении путем химических манипуляций рекомбинантной молекулы ДНК, которая возвестила о рождении нового направления в генетике и новой области биотехнологии — генной инженерии.

В отличие от классической и молекулярной генетики, генная инженерия имеет своим объектом не клетки, не вирусы, а гены или их группы, оперируя с ними не как с биологическими объектами, а как с молекулами или фракциями молекул. Целью генной инженерии является пересадка генов в гетерогенные системы, их экспрессия для получения кодируемых генами белков — гормонов, ферментов, антигенов и других биологически активных веществ. Главной задачей является выбор таких систем, в

которых продукция биологически активных белков была бы технологически оправданной. Поэтому при выборе клеточных систем, в которые вводятся гены и где обе-спечивается их экспрессия, главным объектом ЯВЛЯЮТСЯ простейшие прокариотные (бактерии) или эукариотные (дрожжи) системы. Впрочем, в дальнейшем была показана целесообразность использования в некоторых случаях высших эукариотных систем (клетки птиц или млекопитающих).

Основным инструментом генноинженерных работ являются некоторые ферменты и в первую очередь рестриктазы. С их помощью удается получить необходимые фрагменты геномов или отдельные гены. В большинстве случаев рестриктазы образуют «липкие концы» в местах разреза молекул ДНК, что дает возможность соединять концы разных генов или генетических элементов. В тех же случаях, когда «липкие концы» не образуются, их создают искусственно, используя ферменты — концевые нуклеотидил-трансферазы. Для ковалентных сшивок нитей ДНК применяются ферменты ДНК-лигазы.

Для переноса в клетку вновь образованной генетической структуры в принципе могут быть использованы следующие методы: гибридизация соматических клеток, пере-садка ядер и хромосом, трансформация клеток с помощью ДНК путем введения чужеродной ДНК в зародышевые и соматические клетки животных и прямая микроинъекция ДНК в ядро клетки. Чужеродный генетический материал можно вводить в клетку с помощью вектора. Вектор — это молекула ДНК, способная к автономной репликации и используемая для переноса чужеродной генетической информации в клетку. Векторами могут быть бактериальные плазмиды либо искусственные образования (би- и тривалентные плазмиды, космиды — производные фагов и плазмид). Удобными векторами для эукариотических клеток являются некоторые ДНК- и РНК-содержащие вирусы животных благодаря их способности к репродукции и существенному накоплению продуктов транскрипции и трансляции. К ним относятся вирусы полиомы, папилломы, SV40, герпеса, аденовирусы, а среди РНК-со- держащих — ретровирусы. Одной из наиболее перспективных векторных систем является крупный ДНК-содержащий вирус — вирус осповакцины.

Кроме того, в ряде случаев применяются дополнительные генетические элементы. Если при образовании генетической структуры в интересующем нас гене произошел «сдвиг рамки», то к месту сдвига рамки или впереди от него необходимо вставить олигонуклеотид, который выправит рамку считывания; такие генетические элементы называются линкерами. Иногда при вырезании гена утрачивается инициирующий кодон АУГ и тогда его приходится ковалентно соединять с началом гена. Во многих случаях необходимо к началу гена присоединить сильно действующий промотор. Иногда приходится отделять промотор, слишком близко расположенный к началу гена, небольшим олигонуклеотидом, который называется спейсером. Иногда для успешного функционирования гена необходимо повторить его несколько раз, поставив один за другим; такой прием называется тандемной амплификацией.

До сих пор речь шла о генах, которые сравнительно легко выделить. Если же речь идет о генах высших эукариотов, например о генах инсулина или интерферонов человека, то прямое их выделение среди миллиона генов, имеющихся в геноме эукариотической клетки,— непосильная задача. Кроме того, гены эукариотов не могут быть непосредственно использованы из-за их мозаичной структуры, заключающейся в чередовании экзонов и интронов. Поэтому для получения таких генов сначала индуцируют синтез соответствующей иРНК (при созревании РНК вырезаны участки, соответствующие нитронам), используя специализированные клетки. Так, иРНК инсулина продуци-руют опухолевые клетки инсулиномы. Для получения иРНК интерферона индуцируют ее синтез в лейкоцитах с помощью разных индукторов интерферона. Выделяют иРНК из полирибосом.

Образцы полученной иРНК подвергают обратной транскрипции с помощью фермента РНК-зависимой ДНК- полимеразы (обратной транскриптазы), получаемой из вирионов птичьего миелобластоза. Этот фермент катализирует синтез сначала нити ДНК, комплементарной иРНК, а затем второй нити ДНК, комплементарной первой (иногда ее синтез производят с помощью бактериальной ДНК- зависимой ДНК-полимеразы). Полученный таким путем ген (в нашем случае — ген инсулина или ген интерферона) подвергают дальнейшим операциям, вводя его в вектор и получая молекулу рекомбинантной ДНК.

Операция обратной транскрипции обязательна также при работе с РНК-содержащими вирусами.

После получения рекомбинантной ДНК на основе вирусного или плазмидного вектора проводят трансфекцию бактериальных клеток на селективной среде, отбирая колонии, в которых проявил себя селективный маркер, например ген устойчивости к ампициллину, разрушенный во время генетических манипуляций. После отбора положи-тельных колоний проверяют наличие вставленного гена методом молекулярной гибридизации и рестрикционного анализа.

Генная инженерия и вирусные вакцины. Генная инженерия создает новые возможности для получения вирус-ных вакцин, и эти возможности заключаются в создании вакцин, состоящих из протективных (вызывающих образование защитных антител) белков. Такие вакцины могут быть получены в прокариотических (бактериальных) системах и в системах низших эукариотов (например, в дрожжах). Однако большинство протективных антигенов вирусов человека являются продуктами сложных внутриклеточных модификаций, которые обычно не могут осуществить клетки прокариотов и низших эукариотов (антигены вирусов полиомиелита, гепатита А, гриппа и др.), и в этом случае для получения вакцин необходимо использовать клетки высших эукариотов, что делает генноинженерные вакцины против ряда инфекций нерентабельными. Однако для вирусов, которые плохо куль-тивируются в лабораторных условиях (например, вирус гепатита А и ряд кишечных вирусов — возбудителей гастро-энтеритов) этот путь остается единственно приемлемым.

Среди новых направлений по созданию генноинженерных вакцин весьма перспективным является использование крупных вирусов животных для введения в их геном генов протективных белков вирусов. Наиболее удачной моделью для этих манипуляций является вирус осповакцины. Этот вирус имеет громадный геном (187 кб), в который без ушерба для репродукции вируса можно встроить до 25 кб чужеродного генетического материала, т. е. несколько генов, кодирующих протективные белки вирусов. Наиболее удобной областью для их введения является область ранних генов вируса осповакцины, в частности ген тимидинкиназы, имеющий сильный промотор. Такая локализация встраивания чужеродного гена, во-первых, обеспечивает его эффективную транскрипцию, во-вторых, не блокирует размножение рекомбинантного варианта вируса осповакцины, и, в-третьих, создает маркер по повреждению гена тимидинкиназы, необходимый для отбора клонов со встроенным чужеродным геном. Особенно детально была исследована возможность получения таким путем вакцины для профилактики гепатита В. Получены ре-

Комбинантные штаммы вируса осповакцины со встроенным в область ранних генов гена HBS-антигена. При внутри- кожной прививке такой вакцины происходит размножение вируса осповакцины и развитие вакцинального процесса, характерного для осповакцины. Одновременно происходят синтез HBS-антигена вируса гепатита В, секреция его из очага вакцинации и индукция специфического иммунитета к гепатиту В. При этом реактогенность рекомбинантного штамма вируса осповакцины не только не повышается, но даже снижается по сравнению с исходным вакцинным штаммом.

Учитывая безопасность вируса осповакцины, его изученность, налаженное производство осповакцины, рекомбинантные вирусы могут быть использованы для одновременной иммунизации против нескольких вирусных инфекций.

Несмотря на большие успехи генной инженерии, трудности, стоящие перед ней, далеко еще не преодолены. Если принять за 100% путь от начала исследований до промышленного, коммерчески выгодного продукта, будь то вакцина, интерферон или гормон, то можно следующим образом оценить каждый из трех основных этапов этой задачи: получение рекомбинантных молекул на. основе прокариотного или эукариотного вектора—10%, получение экспрессии интересующего исследователей гена — 30 %, выход на экономически выгодную технологию—60%.

И тем не менее, несмотря на все эти трудности, ген-ная инжёнерия стала ядром современной биотехнологии и с каждым годом вклад ее в производсто будет возрастать.

Глава 8. ПАТОГЕНЕЗ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Под инфекцией понимают комплекс процессов, происходящих при взаимодействии инфекционного агента с организмом хозяина. Однако в связи с тем, что вирусы являются внутриклеточными паразитами, а точнее, генетическими паразитами, в основе их взаимодействия с организмом всегда лежит инфекционный процесс на уровне клетки, который реализуется путем взаимодействия вирусного и клеточного геномов. Поэтому возможно классифицировать инфекции как на клеточном уровне, так и на уровне организма (схема 2). Уровень клетки

Уровень организма

КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

НА КЛЕТОЧНОМ УРОВНЕ

Автономные и интеграционные инфекции. Если вирусный геном реплицируется независимо от клеточного генома, такая инфекция называется автономной. Понятие автономии относительно, оно ограничивается лишь отсутствием физической связи между вирусным и клеточным геномами, хотя взаимодействие их постоянно происходит в течение инфекции. Автономная форма вирусной инфекции характерна для большинства вирусов животных.

Если вирусный геном включается в состав клеточного генома, или, как принято называть этот процесс, интегрирует с клеточным геномом и реплицируется вместе с ним, такая инфекция называется интеграционной. Интеграционная инфекция возникает в результате физического объединения генома вируса и клетки. При этой форме инфекции вирусный геном реплицируется и функционирует как составная часть клеточного генома. Интегрировать могут как полный геном, так и часть генома. При гепатите В возможна интеграция полного генома, при аденовирусных и герпесвирусных инфекциях обычно интегрирует часть генома, при инфекции онковирусами может интегрировать как полный геном, так и часть его. Вирусные последовательности в составе клеточного генома называются провирусом, или провирусной ДНК.

При интеграционных инфекциях нет ни сборки вирусной частицы, ни выхода вируса из клетки. Клетка может сохранить нормальные функции и при ее делении вирусные последовательности могут переходить в геном дочерних клеток. Такая ситуация наблюдается в случае инфекции, вызванной онкогенными вирусами. Интеграция может привести к неопластической трансформации клетки. Трансформированная клетка приобретает способность к неограниченному делению в результате нарушения регуляторных механизмов, контролирующих деление. Ин-теграционный тип инфекции возможен для нескольких семейств ДНК-содержащих вирусов: аденовирусов, папо- вавирусов, вирусов герпеса, а также для вируса гепатита В и обязателен для одного семейства РНК-содержащих вирусов — ретровирусов. В соответствии с данными В. М. Жданова, интеграционная форма инфекции может возникнуть при заражении и другими РНК-содержащими вирусами, такими, как вирус клещевого энцефалита (семейство тогавирусов), вирусы кори и SV5 (семейство парамиксовирусов) и др. Обязательным условием в этом случае является присутствие в клетках фермента — обратной транскриптазы, необходимого для процесса интеграции. Возникающая интеграционная инфекция может явиться причиной ряда хронических и аутоиммунных заболеваний.

Механизм интеграции вирусного генома с клеточным геномом. Из многих моделей, объясняющих процесс интеграции, наиболее признанной является модель Кемпбелла. В соответствии с этой моделью для интеграции с клеточным геномом необходима кольцевая форма двунитчатой вирусной ДНК. Эта молекула ДНК прикрепляется к клеточной ДНК, в месте прикрепления обе молекулы разрезаются и образовавшиеся концы сшиваются таким образом, что вирусная ДНК становится частью клеточного генома (рис. 27). Существенную роль в интеграции играют длинные концевые повторы двунитчатой ДНК, которые определяют специфичность интеграции ¦в результате узнавания ими определенных участков клеточного генома. ДНК паповавирусов является циркуляр-

Рис. 27. Интеграция вирусного генома с клеточным (схема).

1— вирусная ДНК; 2— геном клетки; 3— процесс интеграции; 4— клеточный геном с ДНК-провирусом.

ш

tt

ной и двунитчатой и полностью отвечает требованиям модели Кемпбелла.

Продуктивная и абортивная инфекции. Инфекция может быть продуктивной и абортивной. Продуктивная инфекция завершается образованием инфекционного потомства. Абортивной называется инфекция, которая не завершается образованием инфекционных вирусных частиц, или они образуются в гораздо меньшем количестве, чем при продуктивной инфекции. Абортивная инфекция может возникнуть при следующих трех обстоятельствах: 1) заражение чувствительных клеток дефектным вирусом; 2) заражение чувствительных клеток в неразрешающих условиях; 3) заражение нечувствительных клеток стандартным вирусом.

Заражение чувствительных клеток де-фектным вирусом. Дефектным называется такой ви-рус, который не способен проявить все генетические

функции, необходимые для образования инфекционного ' потомства.

Существуют дефектные вирусы и дефектные вирусные частицы. Дефектными называются такие вирусы, которые репродуцируются лишь в присутствии вируса-помощника, например аденоассоциированный вирус (семейство парвовирусов), дающий потомство только в присутствии аденовируса-помощника. Дефектные вирусные частицы накапливаются в популяции многих вирусов, особенно при пассировании их с высокой множественностью инфекции. Дефектные частицы интерферируют при репро-дукции вируса с инфекционными вирусными частицами и потому называются дефектными интерферирующими ча-стицами (ДИ-частицами). Этот тип вирусных частиц наиболее хорошо изучен на модели вирусов везикулярного стоматита и гриппа. Получение дефектных частиц вируса гриппа при заражении куриных эмбрионов с высокой множественностью инфекции получило название феномена фон Магнуса по имени исследователя, впервые его описавшего. Дефектные вирусные частицы вызывают абортивную инфекцию в связи с тем, что они лишены части генетического материала. Например, дефектные частицы вируса гриппа содержат неполные последовательности P-генов, кодирующих три высокомолекулярных вирусных белка.

Заражение чувствительных клеток в неразрешающих условиях. Абортивная Инфекция может возникать при изменении условий, в которых происходит инфекционный процесс. Эти условия возникают в организме и могут моделироваться в эксперименте; в организме — повышение температуры, изменение pH в очаге воспаления и концентрации ионов, наличие антиметаболитов, ингибиторов и т. д.; в эксперименте — изменение температуры инкубации, состава питательной среды, внесение антиметаболитов и ингибиторов и т. д. В результате клетка либо погибнет без продукции инфекционного вируса, либо инфекция прерывается на определенном этапе. При устранении неразрешающих условий абортивная инфекция превращается в продуктивную. Смена абортивной инфекции на продуктивную может осуществиться и с помощью вируса-помощника.

Заражение нечувствительных клеток стандартным вирусом приводит к наиболее распространенной форме абортивной инфекции.

Непермиссивность клетки к определенному вирусному

агенту может проявиться на любом этапе инфекции. Чувствительность клетки к ряду вирусов определяется на-личием на клеточной поверхности специфических рецеп-торов, обусловливающих адсорбцию и проникновение вируса в клетку. Такой генетически обусловленный механизм клеточной резистентности наиболее четко установлен для пикорнавирусов, а также онковирусов птиц. Для большинства вирусов можно подобрать две клеточные системы, в одной из которых будет развиваться продуктивная, а в другой — абортивная инфекция. Механизм генетически обусловленной резистентности клеток к вирусам широко варьирует, но в основе его лежит либо отсутствие клеточных факторов, необходимых для репродукции вируса, либо наличие факторов, нарушающих процесс репродукции.

У сложно устроенных вирусов клеточная непермис- сивность часто проявляется на стадии сборки вирусных частиц; нарушение сборки в некоторых непермиссивных системах для вирусов гриппа и парамиксовирусов обусловлено уменьшением количества молекул матриксного белка вируса.

Острая и хроническая инфекция. Как продуктивная, так и абортивная инфекция может протекать в виде острой или хронической инфекции.

Острой называется такая форма инфекции, при которой после образования вирусного потомства клетка либо погибает, либо выздоравливает и не содержит вирусных компонентов. Хроническая инфекция — это такая форма инфекции, при которой клетка продолжает продуцировать вирусные частицы или вирусные компоненты в течение длительного времени и передает эту способность дочерним клеткам.

Чаще хроническую форму приобретает абортивная инфекция, так как вирусный генетический материал обычно не входит в состав вирусного потомства, а накапливается в клетках и передается в дочерние клетки. Одним из факторов, вызывающих хроническую инфекцию, являются ДИ-частицы. Такие частицы, попадая в клетки вместе с инфекционными вирусными частицами, конкурируют с ними за факторы репродукции и препятствуют образованию инфекционного потомства. В результате гибель клеток предотвращается. При появлении в системе новых чувствительных клеток в них вновь возникает продуктивная инфекция с образованием ДИ-частиц, и такой цикл инфекции возобновляется снова и снова.

Цитолитическая и нецитолитическая инфекции. Острая инфекция на клеточном уровне может быть цитолитической и нецитолитической в зависимости от судьбы зараженной клетки. Инфекция, завершающаяся гибелью (лизисом) клетки называется цитолитической. Инфекция, которая непосредственно не приводит к лизису клетки, и клетка еще может функционировать в течение некоторого периода времени, продуцируя вирусные частицы, называется нецитолитической.

Смешанная инфекция. В естественных условиях распространен феномен смешанной инфекции, при котором клетка заражается двумя или несколькими разными вирусами. Два и больше инфекционных процесса, происходящих одновременно в одной клетке, могут оказывать различное влияние друг на друга. Возможны несколько вариантов взаимодействия вирусов в процессе смешанной инфекции.

Один из вирусов подавляет репродукцию второго вируса, или подавляется репродукция обоих вирусов. Этот феномен называется интерференцией вирусов.

Вирус усиливает репродукцию второго вируса в результате комплементации или экзальтации. Комплементация может происходить между двумя родственными или неродственными вирусами, например между аденовирусом и аденоассоциированным вирусом человека или SV40, при этом вирус-помощник предоставляет другому вирусу неструктурный белок. Экзальтация может быть связана с подавлением процесса образования интерферона первым вирусом.

Оба вируса не оказывают существенного влияния на процесс репродукции каждого из них, однако может происходить нарушение морфогенеза обоих вирусов.

Смешанная инфекция широко используется вирусологами для изучения генетических функций вирусов и дефектности геномов.

ЦИТОПАТОЛОГИЯ ЗАРАЖЕННОЙ ВИРУСОМ КЛЕТКИ

Патологические изменения зараженных вирусами клеток обусловлены специфическими и неспецифическими процессами. К неспецифическим процессам относятся про-цессы, обусловленные изменением проницаемости плазма-тической мембраны, маргинация хроматина, хромосомные аберрации, пикноз ядер, вакуолизация цитоплазмы. По-следнее свойство может приобретать настолько своеобразный и выраженный характер, что превращается в специфический признак некоторых вирусных инфекций. Так, один из вирусов, вызывающий такой процесс,— SV40 — получил название «вакуолизирующий вирус». Специфическими изменениями являются, например, вирусные включения, образование симпластов. Специфические и неспецифические процессы моїут привести к деструкции клетки.

Цитопатический эффект и' его причины. Деструкцию клетки, возникающую при цитолитической инфекции, на-зывают цитопатическим эффектом, а вирус, вызывающий этот эффект, называют цитопатогенным. Большинство вирусов животных являются цитопатогенными, и это свойство лежит в основе патогенеза ряда вирусных инфекций. Цитопатический эффект широко используется в лабораторной диагностике вирусных инфекций для индикации вируса в культуре клеток и выявления антител в сыворотках переболевших.

Цитопатический эффект является следствием нескольких причин: 1) нарушение нормальной жизнедеятельности клетки в результате механического повреждающего действия вирусных компонентов на клеточные структуры;

повреждение лизосом, в результате чего освобождаются высокоактивные лизосомальные ферменты, вызывающие аутолиз клетки; 3) интенсивное истощение белковых и энергетических ресурсов клетки за счет переключения клеточных ферментов и белок-синтезирукнцего аппарата на синтез вирусспецифических макромолекул; 4) специфическое повреждающее действие вирусов на клеточные молекулы. Эти причины повреждения клетки различным образом проявляются и сочетаются при разных вирусных инфекциях.

Среди РНК-содержащих цитопатогенных вирусов пикорнавирусы оказывают наиболее быстрое и глубокое действие на синтез клеточных белков. Причиной выключения белкового синтеза является блокирование узнавания рибосомой «шапочки» клеточных иРНК. Поскольку РНК вируса полиомиелита транслируется по механизму, неза-висимому от «шапочки», происходит селективное подавление трансляции клеточных иРНК.

Вирусные включения. Вирусные включения, выявляющиеся при окрашивании зараженных клеток, являются специфическими морфологическими признаками вирусной инфекции, часто имеющими диагностическое значение. Внутриклеточные вирусные включения были обнаружены гистологами еще в прошлом столетии. Д. И. Ивановский обнаружил в клетках растения, зараженного вирусом

но (cij^Vj

1 2 со С®)/ \

4 5 (?)(&)

6 7 г**)

8 Рис. 28. Типы вирусных включении (схема).

1 — клетки, зараженные вирусом оспы (тельца Гварниери); 2 — клетки, зараженные вирусом герпеса (тельца Каудри) *, 3 — клетки,зараженные аденовирусом; 4 — клетки, зараженные паповавирусом SV40; 5 *— клетки, зараженные рео- вирусом; 6 — клетки, зараженные вирусом бешенства (тельца Негри); 7 — клетки, зараженные вирусом гриппа; 8 — клетки, зараженные вирусом корн; цитоплазматические и внутриядерные включения обозначены черным цветом.

табачной мозаики, кристаллоподобное включение, которое впоследствии получило название «кристаллы Ивановского». Позже было доказано, что «кристаллы Ивановского» представляют собой скопление вирусов табачной мозаики.

Вирусные включения выявляются в ядре или цитоплазме зараженной клетки. В зависимости от прокрашивания разными красителями включения бывают базофильными и ацидофильными (эозинофильными). Включения при разных вирусных инфекциях различаются по величине, форме, численности. Они могут быть одиночными и множест-венными, крупными и мелкими, округлыми или неправильной формы (рис. 28). Характерные ядерные включения формируются в клетках, зараженных вирусами герпеса, полиомы, аденовирусами, флавивирусами, вирусом ящура. Характерные цитоплазматические включения формируются в клетках, зараженных вирусами оспы, гриппа, бешенства.

Природа включений разнообразна. Большей частью включения представляют собой «вирусные фабрики», т. е. очаги, в которых идет транкрипция и репликация вирусных геномов и сборка вирусных частиц. В клетках, зараженных реовирусом, образуются причудливые серповидные околоядерные включения; при электронно-микроскопическом исследованию они оказались связанными с нитями митотического веретена, в ассоциации с которыми идет репродукция этого вируса. Включения могут представлять собой скопление вирусных частиц, как, например, внутриядерные включения в клетках, зараженных аденовирусами и вирусом полиомы, либо скопление молекул вирусных белков, например ядерные и цитоплазматические включения в клетках, зараженных вируеом гриппа, представляющие собой скопление молекул неструктурного вирусного белка. Некоторые включения содержат только клеточный материал, например ядерные ацидофильные включения в клетках, зараженных вирусами герпеса на поздней стадии инфекции.

Симпласты. Некоторые вирусы вызывают характерный цитопатический эффект, проявляющийся в слиянии клеток и образовании многоядерных клеток, называемых симпластами или синтицием. Образование симпластов обу-словлено действием на клеточные мембраны прилежащих друг к другу клеток вирусных белков слияния и определяется тем же механизмом, который обеспечивает слияние вирусной и клеточной мембраны и проникновение вирусов в клетку. Слияние может происходить как за счет белков родительского вируса при заражении клеток большими концентрациями вируса (слияние снаружи), так и за счет внутриклеточного накопления вновь синтезированных вирусных белков слияния (слияние изнутри). Образование симпластов вызывают многие вирусы: парамиксо- вирусы, некоторые ретровирусы, вирусы герпеса. В определенных условиях (при низких значениях pH) слияние вызывают вирусы гриппа, буньявирусы и др.

Особенности вирусной инфекции в клеточной популяции. Основной особенностью вирусной инфекции в клеточной популяции является гетерогенность-системы в связи с гетерогенностью вирусных частиц и клеток, входящих в состав популяции. В любом вирусном препарате наряду с инфекционными вирионами находятся ДИ-частицы. Клетки в каждой клеточной популяции широко варьируют по чувствительности к вирусу, и инфекция может проте-' кать не так, как на клеточном уровне. Например, при заражении вифусом, вызывающим в клетках продуктивную инфекцию, чувствительные клетки популяции могут погибнуть, и в популяции за счет некоторого количества нечувствительных клеток может установиться хроническая инфекция.

КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

НА УРОВНЕ ОРГАНИЗМА

В основу классификации положены четыре фактора: 1) генерализация вируса; 2) продолжительность инфекции; 3) проявление клинических симптомов; 4) выделение вируса в окружающую среду. Основанная на этих признаках классификация инфекций, как и любая другая, в известной мере условна, поскольку одна форма может перейти в другую, например, очаговая инфекция — в генерализованную, острая инфекция — в хроническую, латентная — в хроническую и т. д.

Очаговая и генерализованная инфекции. Вирусные инфекции можно разделить на две большие группы: 1) очаговые, когда действие вируса проявляется у входных ворот инфекции в связи с его локальной репродук-цией, и 2) генерализованные, при которых после ограниченного периода репродукции вируса в первичных очагах происходит генерализация инфекции, и вирус достигает чувствительных тканей, формируя вторичные очаги инфекции. Очаговые инфекции имеют более короткий инкубационный период, чем генерализованные, защитными факторами организма при этих инфекциях являются скорее секреторные антитела класса IgA, чем антитела гуморальные, а эффективными вакцинами — те, которые стимулируют образование секреторных антител. При генерализованных инфекциях большее значение в защите организма имеют гуморальные антитела. Примером очаговых инфекций являются респираторные и кишечные вирусные инфекции, примером генерализованных — оспа, корь, полиомиелит. Сравнительная характеристика очаговых и генерализованных инфекций представлена в табл. 9. Примером генерализованной инфекции является корь, а очаговой — заболевания, вызываемые респираторно-синцитиальным вирусом, и другие острые респираторные вирусные инфекции.

Таблица 9. Сравнительная характеристика очаговых и генерализованных вирусных инфекций Свойства

инфекции Очаговые

инфекции Генерализованные

инфекции Место патологического процесса Инкубационный пе-риод

Наличие вирусемии Продолжительность иммунитета Иммунные механизмы Входные ворота Относительно короткий Редко

Кратковременный или неизученный Секреторные антитела (IgA), локальный клеточный иммунитет Системы тканей и органов Относительно длинный Обычно

Обычно длительный

Гуморальные антитела (IgG, lgM), системный клеточный иммунитет Острая и персистентная инфекции. Острая инфекция длится относительно непродолжительный период времени и протекает с выделением вирусов в окружающую среду. Окончание инфекции сопровождается элиминацией вирусов благодаря иммунным механизмам. Инфекция может протекать как в клинической, так и в инаппарант- ной форме. Острая инфекция может завершиться выздоровлением или гибелью организма. Она соответствует продуктивной инфекции на уровне клетки. При продолжительном взаимодействии вируса с организмом возникает персистентная форма инфекции (от лат. persisten- tia — упорство, постоянство).

Один и тот же вирус может вызвать как острую, так и персистентную инфекцию в зависимости от состояния организма и в первую очередь его иммунной системы. Например, вирус кори может вызвать как острую инфекцию, так и медленную (длительно текущую) — под- острый склерозирующий панэнцефалит. Вирусы герпеса, гепатита В и аденовирусы могут вызвать острую и персистентную инфекции и т. д.

Персистентные инфекции могут быть латентными, хроническими или медленными в зависимости от выделения вируса в среду и проявления симптомов заболевания.

Латентная инфекция— это скрытая инфекция, не сопровождающаяся выделением вирусов в окружающую среду. При латентных инфекциях вирус не всегда удается обнаружить либо в связи с его дефектным состоянием, либо в связи с персистешщей субвирусных компонентов, либо в связи с интеграцией клеточным геномом. При воздействии ряда активирующих инфекцию факторов может произойти активация вируса, и латентная инфекция может перейти в острую или хроническую. Латентные инфекции могут вызывать аденовирусы, вирусы герпеса, онкогенные вирусы, вирус СПИД и др.

Хронической инфекцией называется длительно текущий патологический процесс, характеризующийся периодами ремиссий, перемежающимися с периодами обострения, когда вирус выделяется в окружающую среду. Примерами хронической инфекции являются герпетическая, аденовирусная инфекции, хроническая форма вирусных гепатитов и т. д.

Медленные инфекции —это своеобразное взаимодействие определенных вирусов с организмом, характеризующееся длительным инкубационным периодом, тянущимся многие месяцы и даже годы, и последующим медленным, но неуклонным развитием симптомов забо-левания, ведущим к тяжелому нарушению функций органов и летальному исходу. К медленным инфекциям относятся медленно прогрессирующие заболевания, в частности, заболевания ЦНС со спонгиоформными энцефалопатиями у человека — куру, болезнь Крейтцфельд- та — Якоба (пресенильная деменция), а у животных — трансмиссивная энцефалопатия норок и скрепи у овец.

К медленным инфекциям относят также подострый склерозирующий панэнцефалит, который вызывается вирусом кори, рассеянный склероз, амиотрофический боковой склероз и некоторые другие заболевания человека и животных.

При некоторых медленных инфекциях существенную роль играют генетические механизмы (скрепи, куру, амиотрофический боковой склероз), при других — иммунопатологические механизмы (подострый склерозирующий панэнцефалит, алеутская болезнь норок, лимфоцитарный хориоменингит).

Персистентные Инфекции являются серьезной проблемой современной вирусологии и медицины. Большинство вирусов человека и животных способны персистировать в организме и вызывать латентные и хронические инфекции, и удельный вес персистентных инфекций намного превышает таковой острых инфекций. При персистентных инфекциях постоянно или периодически происходит выделение вирусов в окружающую среду, и персистентные инфекции являются основным фактором «проэпиде- мичивания» населения. Персистенция вирусов обусловливает их сохранение как биологического вида и является причиной изменчивости свойств вирусов и их эволюции.

Большую роль персистенция вирусов играет в перинатальной патологии. Вертикальная передача персисти- рующего вируса от инфицированной матери плоду и активная репродукция вируса в его тканях особенно опасны в первые месяцы беременности, так как приводят к аномалиям развития плода или его гибели. К числу таких вирусов относятся вирусы краснухи, простого герпеса, ветряной оспы, цитомегалии, Коксаки В и ряд других.

Борьба с персистентными инфекциями затруднена из-за отсутствия адекватных подходов к их лечению и профилактике.

ПАТОГЕНЕЗ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Под патогенезом следует понимать совокупность процессов, вызывающих заболевание и определяющих его развитие и исход. Патогенез вирусного заболевания определяется следующими факторами: 1) тропизмом

вируса; 2) скоростью репродукции вируса и количеством инфекционных частиц в потомстве; 3) реакцией клетки на инфекцию; 4) реакцией организма на вызванные инфекцией изменения клеток и тканей.

Тропизм вируса к определенным клеткам и органам характерен для большинства вирусных инфекций. В зависимости от поражения тех или иных органов и тканей различают нейроинфекции, инфекции дыхательных путей, кишечные и др.

В основе тропизма вирусов лежит чувствительность к вирусу определенных клеток, а, следовательно, тканей и органов. Это свойство вирусов заражать лишь определенные клетки называется зависимым от хозяина ограничением. Патогенность вируса является генетическим признаком, обусловленным соотношением (констелляцией) вирусных генов. Фенотипическим проявлением патогенности является вирулентность. Этот признак значительно варьирует в разных системах. Вирулентность не идентична зависимому от хозяина ограничению, однако при некоторых инфекциях причины, обусловливающие вирулентность вируса, могут определить и возникновение инфекции. Например, вирулентность вируса гриппа в разных клеточных системах обусловлена степенью нарезания гемагглютинина-предшественника на две субъединицы — большую и малую, которое осуществляют клеточные протеазы. Нарезание зависит как от величины, структуры и конформации участка белка, так и от наличия и концентрации специфических клеточных протеаз. При отсутствии нарезания инфекция не возникает, а разная степень его определит вирулентность вируса в данной клеточной системе.

Вирулентность вируса определяется многими факторами организма: конституция, возраст, питание, наличие стресса, естественный и приобретенный иммунитет, интерферон могут определить течение инфекции и ее исход.

Понятие «токсичность» при вирусных инфекциях лишено смысла, так как ни эндотоксинов, ни экзотоксинов применительно к вирусам не существует.

Пути проникновения вируса в организм

Вирус проникает в организм разными путями, которые определяются локализацией чувствительных клеток в организме и механизмом передачи вирусов от одного хозяина к другому.

Одни вирусы используют строго определенный путь проникновения в организм. Например, ортомиксовирусы, ряд парамиксовирусов, коронавирусов, аденовирусов, рино- вирусы способны репродуцироваться только в клетках слизистых оболочек дыхательных путей человека и животных, и, следовательно, единственным путем проникновения в организм является воздушно-капельный. Другие вирусы способны к репродукции в разных клеточных системах. Например, вирусы герпеса и оспы способны вызвать заболевание при внутрикожном, внутривенном, интраназальном, внутримозговом введении.

В естественных условиях возможны следующие пути проникновения вируса в организм.

Воздушно-капельный. Вирус проникает в дыхательные пути в составе капель, попавших -в воздух из дыхательных путей больного. Чем меньше капли, тем легче и глубже они туда проникают. Вирусные частицы могут попадать также с частицами пыли. Крупные частицы пыли оседают на слизистой оболочке носа, а мелкие (не более 2 мкм) могут проникнуть глубоко в дыхательные пути и достичь альвеол.

Воздушно-капельным путем в организм попадают две группы вирусов: 1) респираторные вирусы, которые репродуцируются в эпителии слизистых оболочек дыхательных путей, вызывают местную (реже генерализованную) инфекцию и затем выводятся из организма; 2) вирусы, для которых дыхательные пути являются только входными воротами инфекции. Не вызывая местных поражений ткани, эти вирусы обусловливают генерализованную инфекцию, часто со вторичным поражением дыхательных путей. К таким вирусам относятся вирусы натуральной и ветряной оспы, кори, свинки.

Пищевой. Этим путем в пищеварительный тракт попадают энтеровирусы, реовирусы, многие альфа-вирусы, аденовирусы, некоторые парвовирусы и др.

Трансмиссивный. Вирус проникает в организм при укусе кровососущего насекомого (возбудители трансмиссивных инфекций — арбовирусы и некоторые вирусы семейства рабдовирусов).

Через кожу. Некоторые вирусы проникают в организм через поврежденную или даже неповрежденную кожу, например, вирусы бешенства (при укусе животных), коровьей оспы, папилломы.

Половой. Таким путем в организм проникают вирусы герпеса, бородавок человека (семейство паповавирусов).

Парентеральный. Этим путем в организм попадает вирус гепатита В. Заражение вирусом может произойти при всякого рода парентеральных манипуляциях — хирургических вмешательствах, переливании крови, стоматологических операциях, при маникюре и педикюре и т. д.

Вертикальный. Этот путь передачи встречается, в частности, при интеграционных инфекциях, когда в дочерние клетки попадает клеточный геном с интегрированными последовательностями вирусного генома, и при инфекциях с внутриутробным заражением плода, что характерно для вируса краснухи при заболевании женщин, особенно в первые 3 мес беременности. Поражения плода могут вызывать вирусы цитомегалии, простого герпеса, Коксаки и др.

Распространение вирусов в организме

Лимфатическая система. Лимфатические сосуды являются одним из основных путей, по которым вирус распространяется от места первоначальной локализации (кожа, слизистая оболочка дыхательных путей и пищеварительный аппарат). Примером распространения вирусов по лимфатической системе является поражение лимфатических узлов после подкожной противооспенной вакцинации, при кори и краснухе, инфицирование миндалин и аденоидной ткани при аденовирусной инфекции. Инфицированные лимфатические узлы могут быть вторичным очагом инфекции.

Кровеносная система. Гематогенный путь является основным путем распространения вируса в организме, и вирусемия является обычным симптомом при большинстве вирусных инфекций. В кровь вирусы могут поступать из лимфатической системы, переноситься с помощью лейкоцитов, проникать в кровеносные капилляры из первично инфицированных тканей. Вирусемия поддерживается путем постоянного поступления вирусов в кровь или же при нарушении механизмов элиминации вирусов из крови. Длительность нахождения вируса в токе крови может определяться размером вирусной частицы: более крупные вирусные частицы быстрее устраняются из тока крови, чем мелкие, поэтому вирусемия обычно имеет место при энтеровирусных инфекциях. Однако даже такие относительно мелкие вирусы, как тогавирусы менее чем за один час на 90% выводятся из крови. Поэтому ряд вирусов использует специальные механизмы для длительной вирусемии. Некоторые вирусы (например, вирусы оспы) обладают способностью репродуцироваться в клетках сосудистого эндотелия, откуда непосредственно попадают в кровь; многие вирусы фагоцитируются макрофагами, которые разносят их по организму и защищают от иммунных факторов. Доставка вируса макрофагами в лимфоузлы может лишь благоприятствовать инфекции, если вирус размножается в клетках лимфоцитов, поступая оттуда в кровь. Помимо макрофагов, Ъирус может связываться с другими клетками крови. Так, вирусы гриппа и парагриппозные вирусы адсорбируются на эритроцитах, вирусы кори, паротита, герпеса, полиомиелита, клещевого энцефалита и др. адсорбируются на лейкоцитах, а некоторые вирусы способны репродуцироваться в лейкоцитах.

Нервные стволы. Нейрогенный путь распространения вирусов вдоль периферических нервов присущ вирусам бешенства, простого герпеса, полиомиелита. Вирус бешенства распространяется от входных ворот инфеющи — места укуса — по нервам центростремительно к ЦНС, а оттуда — в слюнные железы, из которых вирус выделяется в слюну. Распространение вирусов герпеса в организме при опоясывающем герпесе происходит не только гематогенным, но и нейрогенным путем, при этом вирус может персистировать в дорсальных ганглиях и при определенных условиях может активироваться и распрост-раняться по чувствительному нерву в обратном направлении. Рецепторы для вирусов герпеса обнаружены в синапсах нервных клеток. Вирус может распространяться по аксонам центробежно и центростремительно со скоростью 200—400 мм в сутки.

Скорость распространения вирусов в организме и достижения чувствительных тканей определяет длительность инкубационного периода. Короткий инкубационный период имеют очаговые инфекции (грипп и другие респираторные инфекции, вирусные гастроэнтериты и др.), длительный — инфекции, возбудители которых попадают в чувствительные ткани после генерализации процесса (вирусные гепатиты).

СБОРНЫЕ ГРУППЫ ВИРУСОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ

МАССОВЫЕ ИНФЕКЦИИ

Вирусы, вызывающие респираторные инфекции. Виновниками острых респираторных заболеваний, помимо вирусов гриппа типов А, В и С, являются более 200 вирусов (включая их разные серотипы) и более 50 различных микроорганизмов — стафилококки, стрептококки, мико-плазмы, хламидии и др. Заболевания дыхательных путей, так называемые острые респираторные заболевания (ОРЗ), вызывают парагриппозные, респираторно-синцитиальные вирусы (семейство парамиксовирусов), рино- вирусы, вирусы Коксаки и ECHO (семейство пикорна- вирусов), коронавирусы, аденовирусы. Наибольший удельный вес среди этих вирусов занимают риновирусы, которые не вызывают никаких других заболеваний, и коронавирусы; наиболее тяжелые заболевания с вовлечением нижних дыхательных путей вызывают респираторносинцитиальный вирус и вирус парагриппа типа 3.

Симптомы, наиболее типичные для респираторных заболеваний, вызываемых респираторными вирусами, показаны на рис. 29.

Вирусы, вызывающие гастроэнтериты. Большинство вирусов не вызывают первичной инфекции желудочно- кишечного тракта, поскольку они гибнут при контакте с кислой средой желудка и желчью двенадцатиперстной Вирусы Симптомы РЛ

1 рлт

2 ф

3 HP

4 б

5 бл

6 бп

7 н

8 Вирусы гриппа А и В т \т— """ШҐ0 ¦ж "1Ґ ‘т Парагриппозные

вирусы тяґ "Г V Респираторно-

синцитиальные

вирусы —vmr' "Ш" ШГ ' І 1 N Коронавирусы Vn 1 Is Риновирусы Г тг Vi- —шґ Вирусы Коксаки "РГ тг — Вирусы Экхо —шґ U4 — -ш Аденовирусы T ш— "ШҐ И Реовирусы Г иН "V/Л - ш.. Рис, 29. Диаграмма клинических симптомов при респираторных инфекциях, вызванных различными вирусами.

1—ринит, ларингит (без температуры); 2—ринит, ларингит (с температурой); 3— фарингит; 4— круп; 5— бронхит; б— бронхиолит; 7— бронхопневмония; 8— конъюнктивит.

кишки. Однако есть вирусы, которые не разрушаются при этих условиях и вызывают первичные поражения слизистой оболочки пищеварительного тракта.

К вирусам, вызывающим гастроэнтериты у человека, относятся ротавирусы (семейство реовирусов), вирус Норфолка, кишечные аденовирусы, калицивирусы, астро- вирусы, коронавирусы и неидентифицированные мелкие сферические вирусные частицы (табл. 10).

Энтеровирусы, включая вирусы полиомиелита, Кок- саки и ECHO, обычно не являются возбудителями гастроэнтеритов. После первоначальной репродукции в пищеварительном тракте они вызывают генерализованную инфекцию с поражением ЦНС.

Острые вирусные гастроэнтериты являются широко распространенной инфекцией, которая встречается как в эпидемической, так и эндемической форме. Эти ин-

ш

Таблица 10. Кишечные вирусы (возбудители вирусных гастроэнтеритов) Вирусы Семейство Размер вирусной частицы, нм Преимущественно

поражаемые

возрастные

группы Ротавирусы Reoviridae 70—75 Дети 6—24 мес Вирус Норфолка Caliciviridae 27 Дети и взрослые Калицивирусы Caliciviridae 20—30 Дети 6—24 мес Кишечные аде Adenoviridae 7.0—90 Дети до 3 лет новирусы (се- ротипа 40 и 41) Кишечные ко Coronaviridae 80—130 Дети и взрослые ронавирусы Астровирусы He классифи-цированы 29—30 Дети до. 3—4 лет Мелкие сфери-ческие вирусы He классифи-цированы 25—35 Дети и взрослые фекции поражают разные возрастные группы и занимают второе место по частоте заболеваемости после респираторных вирусных инфекций. Болезнь имеет острое начало и сопровождается поносом, тошнотой, рвотой, падением температуры, болями в желудке, головной болью, недомоганием, миалгией.

Основной трудностью в изучении этих вирусов является отсутствие адекватных методов их накопления и пассирования в лабораторных условиях. Для культивирования ротавируса человека требуются специальные условия, хотя ротавирусы животных сравнительно легко культивируются в культурах клеток. Вирус Норфолка, калицивирусы, астровирусы, коронавирусы, серотипы 40 и 41 аденовирусов не культивируются в обычных условиях. Даже кишечные аденовирусы отличаются отсутствием способности репродуцироваться в обычных культурах клеток. Поэтому основным методом изучения этих вирусов является ЭМ экстрактов фекалий больных гастроэнтеритами, а основным способом изучения их патогенеза — заражение добровольцев (в США и других странах). Возникла новая область вирусологии, изучающая эти вирусы,— фекальная вирусология, основанная на методах ЭМ и ИЭМ. В последнее время разработаны ИФА и РИА, позволяющие выявлять антигены кишечных вирусов в фекалиях. Наибольшее значение имеют ротавирусы, вирус Норфолка и аденовирусы.

Вирусы, вызывающие гепатиты. Первичное поражение печени вызывают следующие вирусы: вирус гепатита А, относящийся к семейству пикорнавирусов (энтеровирус типа 72), вирус гепатита В, относящийся к семейству гепаднавирусов, и сборная группа неклассифицированных вирусов, вызывающих гепатиты ни А ни В. По клиническому течению заболевания, вызванные разными вирусами, не всегда легко отличить друг от друга. Из числа больных гепатитами в нашей стране около 30% приходится на долю больных гепатитом В, около 70% — гепатитом А и около 10% — гепатитом ни А ни В. Наиболее тяжелые формы гепатита, сопровождающиеся высокой летальностью, переходом в хроническую форму, длительным носительством антигена, первичным раком печени, вызывает вирус гепатита В. Сравнительные свойства вирусов и вызываемого ими инфекционного процесса показаны в табл. 11.

Таблица И. Сравнительные характеристики вирусных гепатитов Признак Гепатит А Гепатит В Гепатит ни А ни В Вирус (семейство) Пикорнавирус Гепаднавирус Не идентифицированы, по-видимому, разной природы Тип нуклеиновой Однонитчатая Двунитчатая Не известен кислоты РНК ДНК с одно-нитчатым участком Размер вириона 27—32 нм 42—45 нм — Липопротеидная Отсутствует Имеется — оболочка Путь заражения Фекально Парентераль В некоторых случа оральный ный ях — как при ге-патите А, в других — как при гепатите В Возрастные группы Преимущест-венно дети от 4 до 15 лет Дети и взрослые То же Сезонность Чаще август — сентябрь В течение всего го года » » Инкубационный В среднем 25— В среднем 60— » » период 30 дней 90 дней Иммунопатология Нет Есть » » Переход в хрони Не бывает 6-15% В некоторых слу ческую форму чаях как при ге-патите В Носительство Не бывает Длительное То же Летальность Менее 0,1% До 5% Либо как при гепатите А, либо как при гепатите В Иммунная система представляет совокупность лимфо-идных органов и тканей, основной функцией которой яв-ляется распознавание и элиминация чужеродных веществ, преимущественно белковой природы (т. е. веществ, синтез которых не кодирует ДНК хозяина), и обеспечение го-меостаза организма.

Антигены. Основной мишенью действия иммунной системы являются антигены, подавляющее большинство которых имеет белковую природу.

Определенная конфигурация аминокислот на поверхности антигена, обладающая иммуногенными свойствами, называется эпитоп,1 а участки перекрывающихся эпитопов образуют антигенные детерминанты. Антигенные детерминанты располагаются в области молекулы с доступной для антител поверхностью. Антигенные детерминанты могут быть и скрытыми, выходя на поверхность при изменении конформации или частичном расщеплении макромолекулы.

Антитела. Ответной реакцией иммунной системы на введение антигенов является появление антител — специфических иммуноглобулинов (Ig). Существует пять классов иммуноглобулинов, которые обозначаются символами IgM, IgG, IgA, IgD и IgE. Особое внимание привлечено к иммуноглобулину IgG, так как его молекулы составляют большинство всех сывороточных иммуноглобулинов и в значительной степени определяют уровень гуморального иммунитета. Молекулы IgG имеют коэффициент седиментации 7S и построены из идентичных двух тяжелых (Н, haevy) и идентичных двух легких (L, light) цепей, соединенных дисульфидными связями. У тяжелых и легких цепей имеются постоянная и вариабельная области. В вариабельной области имеются аминокислотные после-довательности, способные к специфическому связыванию с разными антигенами. Постоянная область цепей имеет одни и те же аминокислотные последовательности во всех антителах данной подгруппы и в связывании с антигеном не участвует. Антигенсвязывающий центр находится во фрагменте Fab. На другом конце молекулы находится фрагмент Fe, который не связывает антиген, но в нем локализованы центры связывания комплемента, фиксации на клеточных мембранах и ряд других функций. В электронном микроскопе молекулы иммуноглобулинов выглядят в виде структуры V-образной формы, оба конца которой составлены из вариабельных участков пар тяжелых и легких цепей (рис. 30, а). Антитела являются двухвалентными, так как оба конца их могут взаимодействовать с двумя антигенными детерминантами. Антитела класса IgM имеют коэффициент седиментации 19 S и являются пентамерами (рис. 30, б), под влиянием восстанавливающих веществ диссоциируют на пять субъединиц, каждая из которых состоит из двух легких и двух тяжелых цепей с коэффициентом седиментации 7 S, связанных между собой дисульфидными связями. Молекула IgA является димером, состоящим из двух мономеров (рис. 30, в). Функцию связывания димеров осуществляет J-цепь. Иммуноглобулины IgD и IgE являются минорными сывороточными компонентами, т. е. находятся в сыворотке в наименьших концентрациях (табл. 12). При соединении антигена с антителом происходит взаимодействие между поверхностью антигенной детерминанты и активным центром иммуноглобулина, находящимся в вариабельной его части, таким путем, что комплементарные друг другу поверхности соединяются физико-химическими связями.

Таблица 12. Свойства иммуноглобулинов человека Класс Молекулярная

масса Концентрация в сыворотке, мг/10 л Подклассы IgG 150 ООО 800—1800 1; 2; 3; 4 IgM 900 000 60—280 1; 2 IgA 170 000 90—450 1; 2 IgD 150 000 0,3 (в отдель-ных

случаях — до 400) IgE 190 000 0,2 мкг — При введении в организм человека или животных антигенов выработка антител развивается в определенном порядке. При первичном введении антигена вначале по-являются антитела класса IgM (3—6-й день), затем класса IgG (5—14-й день) и, наконец, класса IgA (15—21-й день). При повторном введении антигена антитела IgM- класса образуются в малом количестве и быстро образуются антитела классов IgG и IgA. Иммуноглобулины класса IgM являются антителами первичного ответа, иммуноглобулины класса IgG — основные антитела со строго Fe

ї 1

юа § 8

о о

IgM

Рис. ЗО. Структура антител (а, б, в,). выраженной специфичностью, в то время как иммуноглобулины класса IgA играют роль в формировании местного иммунитета слизистых оболочек (секреторные иммуноглобулины). Иммуноглобулины класса IgE фиксируются на клетках и имеют большое значение в развитии аллергических реакций (гиперчувствительности). Иммуноглобулины IgD обусловливают развитие аутоиммунных процессов и, возможно, препятствуют возникновению толерантности.

Т- и В-лимфоциты. В иммунной системе существуют две независимые, но функционирующие совместно клеточные популяции: Т-лимфоциты (тимусзависимые) и В-лимфоциты (не зависимые от тимуса). В-лимфоциты обеспечивают выработку антител и ответственны, таким образом, за большинство явлений гуморального иммунитета. Клеточный иммунитет обеспечивают Т-лимфоциты, одновременно осуществляющие функцию регуляции как В-, так и Т-системы. Эта функция Т-лимфоцитов опосредуется существованием ряда морфологических и функциональных субпопуляций, основными из которых являются Т-помощники (хелперы), Т-супрессоры, Т-киллеры и Т-индукторы. Отдельную ветвь представляют макрофаги. Иммуногенез обеспечивают восемь типов клеток — четыре типа Т-лимфоцитов, три типа В-лимфоцитов и макрофаги. Среди лимфоцитов периферической крови человека

Рис. 31. Кооперативное взаимодействие трех типов клеток при инициа- ации синтеза антител.

Аг — антиген (вирус); МФ — макрофаг; В — В-лимфоцит; Т — Т-лим- фоцит; IB-гены — гены иммунного ответа; Ig — иммуноглобулины.

55—60% составляют Т-лимфоциты и 25—30% — В-лимфоциты; 10—20% лимфоцитов (нулевые клетки), по-види- мому, являются предшественниками Т- или В-лимфоцитов.

Антителогенез. Предшественники В-клеток в костном мозге превращаются в В-лимфоциты, которые поступают в периферические лимфоидные органы и являются предшественниками трех типов плазматических клеток, продуцирующих антитела классов IgM, IgG и IgA. Подача Т-лимфоцитом включающего сигнала контролируется IR-генами (генами иммунного ответа) (рис. 31). Молекула антигена распознается также и Т-супрессорами, ог-раничивающими пролиферацию В-клеток на различных стадиях иммунного процесса. Т-супрессоры являются также клетками, обеспечивающими «запрет» на образование аутоантител к собственным антигенам организма, т. е. иммунологическую толерантность. Огромное разнообразие антител обеспечивается существованием в организме млекопитающих не менее 1 млн. лимфоидных клеток, способных дать пролиферацию независимому иммуноком- петентному клону, и обусловлено комбинацией вариабель-ных фрагментов легких и тяжелых цепей иммуноглобу-линов.

Моноклональные антитела. Моноклональные антитела получают путем гибридизации лимфоцитов селезенки мышей, иммунизированных определенным антигеном, с клетками злокачественной опухоли иммунной системы мышей — миеломы. Этот метод, предложенный в

00AV В-лимфоциты

О И А V

плазматические клетки

I

°д°уо удоп

а V Д

смешанные антитела

В-лимфоциты

0 0 А V

+ + +

> • • •

клетки миеломы

і і і і

0ИА7

гибридомЫ . I

\ \ t I л д д

па

о

о

моноклональные антитела

Рис. 32. Получение смешанных (а) и моноклональных антител (б) (схема).

1975 г. Милстейном и соавт. основан на способности таких гибридных клеток (гибридомы) к быстрому размножению с образованием клона специфичесих антител. Гибридные клетки можно поддерживать в перевиваемой культуре, а клонируя отдельные гибридные клетки, можно получить клоны, продуцирующие большое количество идентичных антител к одной антигенной детерминанте. Размноженный в культуре клон вводят мышам интра- перитонеально и затем пассируют развившиеся опухоли. Асцитическая жидкость таких опухолей содержит моноклональные антитела в высоких титрах (рис. 32). Моно-клональные антитела позволяют изучать отдельные детерминанты, а применение нескольких клонов позволяет дать исчерпывающую характеристику изучаемой группе вирусов.

Иммуногенез Т-лимфоцитов. Исходным событием иммуногенеза Т-лимфоцитов также является взаимодейст- вне антигена с макрофагом. Антиген взаимодействует со структурами главного антигена гистосовместимости (HLA) макрофага и в таком виде распознается Т-лим- фоцитами; В-лимфоцит также распознает антиген и получает дополнительный сигнал включения от стимулированного Т-лимфоцита. Взаимная активация лимфоцитов происходит благодаря специфическим и неспецифическим гуморальным факторам — лимфокинам и интерлейкинам. В результате происходит пролиферация и дифференциров- ка Т-клеток с образованием клонов эффекторных Т-лим- фоцитов, которые распознают измененную клетку и уничтожают ее. Таким образом, основой иммунного процесса служит кооперативное функционирование клеточной «троицы»: Т- и В-лимфоцитов и макрофага.

Иммунологическая память. Иммунологической памятью называют способность организма давать ускоренные иммунологические реакции на повторное введение антигена. Иммунологическая память в ряде случаев сохраняется многие годы и свойственна как гуморальному, так и клеточному иммунитету. Клетками памяти является часть дочерних В- и Т-лимфоцитов, стимулированных данным антигеном, однако более длительную иммунологи-ческую память имеют Т-лимфоциты.

Факторы неспецифической резистентности. Помимо иммунной системы, в организме существуют факторы неспецифической резистентности. К ним относятся кожные и слизистые покровы, являющиеся механическим препятствием для проникновения возбудителей инфекционных болезней и антигенов; лизоцимы, выделяемые слизистыми оболочками и циркулирующие в крови; пропердиновая система; мукопротеины клеток слизистых оболочек. К факторам неспецифической резистентности относится также система комплемента, состоящая из 12 белков нормальной сыворотки, которая непосредственно взаимодействует с иммунной системой.

ВИРУСНЫЕ АНТИГЕНЫ

Вирусные антигены могут быть вирионными (входящими в состав вирионов) и вирусиндуцированными (находящимися в зараженной клетке). Вирионными антигенами могут быть либо простые белки, состоящие из одной полипептидной цепи, либо надмолекулярные образования, состоящие из нескольких полипептидных белков.

Вирусные антигены находятся и на поверхности зараженных клеток. Эти антигены обусловлены, во-первых, вновь образованными вирусными частицами, еще сохранившими связь с клеточной поверхностью, и в первую очередь вирусными частицами, выходящими из клетки путем почкования; во-вторых, встроенными в плазматическую мембрану клеток вновь образованными вирусными гликопротеидами при репродукции оболочечных вирусов. В процессе репродукции вируса в клетке происходит синтез вирусспецифических неструктурных белков, которые также обладают антигенными свойствами.

Антигенные детерминанты вирусных антигенов. Антитела, вырабатываемые в ходе вирусной инфекции или при введении вирусных антигенов, взаимодействуют не со всей молекулой антигена, а с ее антигенными детерминантами, которые могут иметь разную природу.

На примере гемагглютинина вируса гриппа можно видеть четыре типа антигенных детерминант, которые встречаются у вирусных антигенов. Первые две детерминанты обусловлены первичной последовательностью ами-нокислотных остатков и конформацией вторичной структуры этого участка белка — петлей в случае детерминанты А и а-спиралью в случае детерминанты В. Третья детерминанта (С) образуется в результате взаимодействия сближающихся разных участков мономера гемагглютинина. Наконец, четвертая детерминанта (D) возникает в результате образования тримера гемагглютинина, определяющего его четвертичную структуру.

ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ

Нейтрализация инфекционной активности вируса анти-телами осуществляется двумя путями: 1) в результате необратимых конформационных изменений структуры белков вирусной частицы у сложно устроенных вирусов, в основном структуры молекул гликопротеидов; такой механизм нейтрализации требует участия комплемента; 2) в результате пространственной блокады молекулами антител вирусных прикрепительных белков и предотвращения связывания вириона с клеточными рецепторами. Поскольку на поверхности вирусной частицы прикрепительные белки представлены во множественных копиях, нейтрализация по этому типу требует связывания с вирусной частицей более одной молекулы антител. Связанные с недостаточным числом молекул антител вирусы могут прикрепиться к клетке и вызвать инфекционный процесс.

Гуморальный иммунитет играет важную роль в противовирусном иммунитете, и уровень антител в крови обычно является надежным показателем резистентности к таким вирусным инфекциям, как корь, клещевой энцефалит, полиомиелит и др. Повышение титра антител в парных сыворотках, т. е. взятых в раннем периоде болезни и в период выздоровления, используется для серологической диагностики вирусного заболевания, а исследования парных сывороток, взятых в начале и конце эпидемии у здоровых людей, позволяют оценить частоту бессимптомных форм изучаемой вирусной инфекции.

Гуморальный иммунитет определяют по наличию в крови антител преимущественно класса IgG. Однако при многих инфекциях, в частности при гриппе, ОРЗ, полиомиелите, и других энтеровирусных, ротавирусных инфекциях, важное значение имеет создание местного иммунитета слизистых оболочек дыхательных путей и пищеварительного тракта," связанное с образованием и секрецией антител класса IgA. Содержание их, не всегда коррелирующее с содержанием антител класса IgG, более объективно характеризует степень иммунитета к изучаемой вирусной инфекции.

Поскольку антитела класса IgG появляются не ранее чем через одну неделю после заболевания и длительно циркулируют в крови, они имеют ограниченное значение для диагностики и не свидетельствуют о свежеперенесен- ной инфекции. Основная роль антител класса IgG сводится к защите организма от повторного заражения. Для установления свежеперенесенной инфекции определяют антитела класса IgM, которые появляются раньше, чем IgG, и раньше исчезают.

КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ

Основным механизмом противовирусного иммунитета являются иммунные клеточные реакции, осуществляемые Т-эффекторами, а основную роль в этих клеточных реакциях играют Т-киллеры, которые распознают зараженную клетку в организме и вызывают ее цитолиз. В результате организм освобождается от клеток, продуцирующих инфекционное вирусное потомство.

Индуцированные вирусным антигеном Т-лимфоциты приобретают свойства распознавать вирусный антиген, находящийся на поверхности зараженных клеток. Вирусные детерминанты, распознаваемые Т-лимфоцитами, сходны

Рис. 33. Строение плазматической мембраны зараженной вирусом клетки (схема).

В •— вирусный гликопротеид, пронизывающий мембрану и контактирующий с вирусным нуклеокапсидом на цитоплазматической стороне мембраны; HLA — клеточный антигеи гистосовместимости; П — периферический белок; И — интегральный белок плазматической мембраны; НК — вирусный нуклео-капсид.

или идентичны детерминантам, выявляемым В-лимфоци- тами на поверхности зараженных клеток. Однако в отличие от В-лимфоцитов, Т-лимфоциты распознают только те зараженные клетки, на поверхности которых вирусный антиген сцеплен с клеточными антигенами главного комп-лекса гистосовместимости — HLA у человека (рис. 33).

Т-лимфоциты обладают высокой специфичностью и могут, например, различать клетки, которые заражены вирусами гриппа типа А или гриппа типа В. Однако специфичность Т-лимфоцитов в отношении вирусов относительна и варьирует у разных таксономических групп.

Существенным фактором в противовирусном иммунитете являются макрофаги. Они принимают участие в иммунной стимуляции, распознавании антигена, регуляции пролиферации и дифференцировки лимфоцитов. Кроме того, они являются активными помощниками в разрушении и удалении из организма неродственных антигенов. Цитотоксическая активность макрофагов имеет неспецифический характер и проявляется на ранних стадиях инфекционного процесса.

В противовирусном иммунитете имеют значение и другие факторы клеточного иммунитета, такие как активность естественных киллеров и зависимая от антител цитотоксичность, обусловленная неиммунными лимфоидны-ми клетками.

Клеточный иммунитет, как указывалось, играет более важную роль при вирусных инфекциях, нежели гуморальный иммунитет. Лишь часть вирусов (в частности, пикор- навирусы) быстро разрушают пораженные ими клетки, большинство же вирусов не вызывают немедленной их гибели, а онкогенные вирусы, наоборот, вызывают про-лиферацию пораженках клеток. Поэтому зараженные клетки становятся мишенью для цитолитического действия Т-эффекторов, естественных киллеров и макрофагов. Цито- литическое действие имеет место при всех вирусных ин-фекциях и поэтому должно быть отнесено вместе с интер-фероном (см. далее) к основным факторам, способствующим выздоровлению организма от вирусной инфекции.

Особенности иммунитета при некоторых вирусных ин-фекциях. Продолжительность и прочность иммунитета варьирует при разных вирусных инфекциях. Так, при оспе, кори, паротите иммунитет является весьма прочным. При другах вирусных инфекциях иммунитет не столь стоек и продолжителен и поэтому возможны повторные заболевания. Это, по-видимому, относится к некоторым пара- миксовирусам (респираторно-синцитиальный вирус), а также к риновирусам, хотя повторное заражение может объясняться заражением другими серологическими типами риновирусов.

Своеобразны особенности иммунитета при гриппе. Перенесенная инфекция создает стойкий иммунитет: так, первая волна гриппа в 1977—1978 гг., вызванная вирусом H1N1, циркулировавшим в 1957 г., характеризовалась тем, что заболели почти исключительно лица моложе 20 лет, родившиеся после 1957 г. Таким образом, повторные заболевания гриппом одного и того же серотипа связаны не с нестойкостью иммунитета, а с антигенным дрейфом двух поверхностных вирусных белков. О прочности иммунитета при гриппе свидетельствует феномен антигенной доминанты или «первородного антигенного греха». При повторных заболеваниях гриппом наряду с появлением антител к вирусу, вызвавшему заболевание, стимулируется рост антител к вирусу, с которым произошла первая встреча данного индивидуума. Этот феномен был широко использован для «серологической археологии» — выяснения, какие вирусы гриппа циркулировали в прошлом, до их открытия.

Многие вирусы персистируют в организме, несмотря на наличие антител. Например, аденовирусы могут длительно персистировать в миндалинах, вирусы герпеса мо-гут длительно и даже пожизненно сохраняться в нервных Клетках чувствительного ганглия тройничного нерва или в дорзальных ганглиях. При ряде персистентных вирусных инфекций причиной персистенции является недоступность вируса для циркулирующих в крови антител. Некоторые вирусы способны распространяться из клетки в клетку без выхода во внеклеточное пространство. Например, вирусы герпеса могут проникать из одной клетки в другую по цитоплазматическим мостикам. Многие вирусы (вирусы парагриппа человека, кори, респираторносинцитиальный и др.) вызывают слияние соседних клеток и распространяются путем формирования симпласта или синцития. Возможно проникновение вируса и субвирусных компонентов в дочерние клетки при клеточном делении. Существует несколько способов «ускользания» вирусов от иммунологического надзора: 1) подавление фагоцитоза; 2) угнетение Т- и В-системы; 3) особая локализация вируса в организме, защищающая его от действия им- муноцитов. В результате создаются условия для распространения вируса в организме и его персистенции. Нарушение функции лимфоцитов имеется при большинстве вирусных инфекций. Вирусы гриппа, кори, полиомиелита, герпеса, ротавирусы и особенно вирус СПИД угнетают иммунные реакции Т-лимфоцитов, препятствуют их стимуляции. Вирус СПИД вызывает, деструкцию Т-хелперов. Вирусы герпеса — возбудители ветряной оспы и опоясывающего герпеса, цитомегалии, инфекционного мо- нонуклеоза — приводят к увеличению абсолютного и относительного количества Т-супрессоров. Активацию супрессоров вызывает вирус клещевого энцефалита.

Таким образом, приобретенный иммунитет после перенесенной вирусной инфекции может быть разным: в одних случаях он защищает от повторных заболеваний на многие годы или на всю жизнь; в других случаях утрачивается через несколько лет и даже месяцев, в связи с чем возможны повторные заболевания; в третьих случаях иммунитет не предотвращает персистирование вируса в организме и появление периодических рецидивов.

ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

В иммунологии иммунопатологическими реакциями называют такие иммунологические феномены, которые приводят к повреждению органов и тканей хозяина и одновременно направлены против возбудителя. Однако при вирусных инфекциях наряду с иммунопатологическими реакциями, наблюдающимися и при других инфекциях (образование иммунных комплексов, аутоантител и др.), встречаются и необычные феномены, которые также можно отнести к иммунопатологии.

Сохранение инфекционности вируса в иммунном комплексе и макрофагах. При взаимодействии вирусов с антителами могут формироваться иммунные комплексы, в которых вирусы сохраняют инфекционную активность. Обычно это имеет место при использовании недостаточной концентрации антител, однако избыток антител не всегда оказывает дополнительный инактивирующий эффект при ряде инфекций. Длительная циркуляция в организме таких иммунных комплексов приводит, во-первых, к постоянному инфицированию чувствительных клеток, во-вторых, к антигенной стимуляции вирусспецифических иммуно- компетентных клеток. В результате формируются новые иммунные комплексы, содержащие инфекционный вирус. Образующиеся иммунные комплексы фиксируются на клетках, содержащих рецепторы к Fc-фрагменту иммуноглобулина, и в результате создаются условия для прикрепления и проникновения в клетки вируса.

Увеличение количества связавшегося' с клеткой вируса, находящегося в составе иммунных комплексов, объясняется следующими причинами.

Клеточные рецепторы для ряда вирусов не могут обеспечить такого эффективного проникновения в клетку, как Fc-рецепторы. —

Агрегированный вирус труднее проникает в клетку, чем мономерная вирусная частица, окруженная антителами.

Антитела защищают вирус от протеолитической деградации клеточными ферментами.

Феномен парадоксального усиления репродукции вирусов при использовании недостаточных концентраций анти-вирусных антител присущ многим вирусам: альфа- и флавивирусам, буньявирусам, рабдовирусам, реовирусам. Особенно четко этот феномен проявляется при заражении вирусами макрофагов: связанные с антителами вирусные частицы лучше размножаются в макрофагах по сравнению со свободными. Наиболее четко феномен проявляется при использовании вируса денге (флавивирус).

Макрофаги способны фагоцитировать многие вирусы.

Однако не все фагоцитированные вирусы разрушаются ферментными системами макрофагов; незавершенный фагоцитоз в ряде случаев может не предотвращать развитие инфекции, а становиться ее источником. Такая инфекция может протекать как в острой, так и хронической форме. Примером устанавливающейся персистенции при взаимодействии вируса и макрофагов является экспериментальная цитомегалия.

Иммунная деструкция зараженных клеток. Клеточные мембраны могут разрушаться гуморальными факторами — лимфотоксинами, которые синтезируются лимфоцитами. Лимфотоксины оказывают неспецифическое ферментативное действие вблизи секретирующих их клеток. Однако основным механизмом деструкции зараженных клеток является цитотоксическое действие Т-лимфоцитов. Вирус- специфические Т-киллеры появляются вскоре после заражения, через 1—3 сут. Способность Т-лимфоцитов разру-шать зараженные клетки может Приводить не только к защитному эффекту и выздоровлению от инфекции, но и к иммунопатологическим реакциям в результате поражения органов и тканей. Защитное или повреждающее действие Т-лимфоцитов зависит от стадии инфекции, в течение которой они действуют. Если разрушение зараженных клеток происходит на ранних стадиях инфекции, гибель немногочисленных зараженных клеток, находящихся, в основном, у входных ворот инфекции, не приведет к на-рушению гомеостаза, и наступит выздоровление. Напротив, при действии Т-лимфоцитов на более поздних стадиях инфекции, когда в результате распространения вируса в организме повреждены клетки многих органов и тканей, иммунный цитолиз может привести к некомпенсируемым нарушениям жизненно важных функций организма и усу-губить инфекционный процесс.

В ряде случаев специфические антитела могут воздействовать на клетки в отсутствии комплемента (при некоторых иммунодефицитных состояниях, поражении нервных клеток, недоступных для комплемента и т. д.). Антитела в отсутствие литического действия комплемента приводят к уменьшению выхода вирусных белков на клеточную поверхность, в результате чего может развиться внутриклеточная персистенция вирусных компонентов.

Единый механизм, лежащий в основе защитного и повреждающего действия иммунных Т-лимфоцитов, предполагает обязательное участие иммунопатологического компонента в патогенезе любой вирусной инфекции, и иммунопатологию можно рассматривать как обязательную плату за выздоровление при вирусных инфекциях. При разных инфекциях вирусной этиологии соотношение защитного и повреждающего действия Т-лимфоцитов существенно варьирует.

Аутоиммунные антитела. Деструкция зараженных вирусом клеток в процессе инфекции приводит к появлению антигенно измененных клеточных структур, которые вос-принимаются организмом как чужеродные и вызывают формирование гуморальных и клеточных факторов имму-нитета, способных взаимодействовать с антигенами нор-мальных клеток. Конформационная перестройка молекулы антигена, взаимодействующего с антителом, также является причиной образования аутоантител против собственных иммуноглобулинов. В результате возникают аутоиммунные реакции. В их патогенезе важную роль играет нарушение сосудистой проницаемости под действием иммунных ком-плексов. В результате происходит антигенная стимуляция элементов лимфоидной ткани, синтез аутоантител и фор-мирование ауто-Т-лимфоцитов, разрушающих ставшие чужеродными клеточные антигены. Аутоиммунные процессы часто приводят к развитию осложнений при вирусных инфекциях. С аутоиммунными процессами связано, на-пример, возникновение орхита как осложнения при вирусном паротите, обусловленного повышением проницаемости кровеносных и лимфатических сосудов тестикулярной ткани; возникновение миокардита при инфекции, вызванной вирусами Коксаки. У больных хроническим гепатитом В обнаруживаются клетки с цитотоксической активностью к гепатоцитам, которая реализуется в присутствии антител против специфического липопротеина печени, находящегося на поверхности гепатоцитов.

Иммунокомплексная патология. Образование иммунных комплексов при взаимодействии вируса с антителами является важным механизмом, обеспечивающим выздоровление и формирование противовирусного иммунитета. Однако иммунные комплексы могут оказывать не только защитное, но и повреждающее действие на организм. Им-мунокомплексная патология широко распространена при вирусных инфекциях и играет значительно большую роль в их патогенезе по сравнению с другими инфекционными и неинфекционными болезнями.

В образовании иммунных комплексов участвуют преимущественно антитела класса IgG, однако их формирование может происходить и с участием IgM- и IgA-антител.

Так, IgM- и IgA-антитела в составе иммунных комплексов были обнаружены в клубочковых отложениях почек при алеутской болезни норок, инфекционном мононуклеозе, гепатите В. Формирование иммунных комплексов происходит как в жидкой среде, так и на поверхности зараженных вирусом клеток. Может происходить связывание антител с вирусными гликопротеидами, расположенными на поверхности зараженных клеток, с последующим освобождением иммунных комплексов во внеклеточное пространство. Такие иммунные комплексы образуются при кори. Размер, растворимость и биологическая активность комплексов за-висят от отношения антигена к антителу и их относительной концентрации. Иммунные комплексы склонны к агрегации и вторичному связыванию различных молекул: компонентов комплемента, антител к ним, антиглобулинов, антиидиотипических антител.

Судьба иммунных комплексов и их биологическая активность в организме могут быть различными. Они могут взаимодействовать с клетками иммунной системы путем связывания с рецепторами к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, при этом аффинитет к рецепторам иммунных комплексов повышен по сравнению с иммуноглобулином. Взаимодействие с рецептором ведет к активации клеток, секреции биологически активных веществ, которые увеличивают проницаемость сосудов, активизируют свертывающую систему крови и т. д. Иммунные комплексы могут изменить гуморальный и клеточный ответ путем взаимодействия с В- и Т -клетками, усиливать или подавлять активность лимфоцитов.

Иммунные комплексы могут циркулировать в кровотоке и в межтканевой жидкости. Крупные иммунные комплексы быстро выводятся из циркуляции с участием системы мононуклеарных фагоцитов. Мелкие иммунные комплексы могут фиксироваться в стенках сосудов или мембранах почечных клубочков. Иммунные комплексы, находящиеся в межтканевых пространствах, плохо выводятся и вызывают локальное воспаление ткани. Укрупнение иммунных комплексов, их сорбция на стенках сосудов и тканях вызывают повреждение органов и тканей и обусловливают «болезни иммунных комплексов», патогенез которых связан с развитием гломерулонефрита. и впервые разработан при сывороточной болезни.

Элементы иммунокомплексной патологии встречаются при большинстве вирусных инфекций и играют значительную роль в их патогенезе. Наиболее изучена иммуноком- плексная патология при гепатите В, герпетической инфекции, геморрагической лихорадке денге, подостром склеро- зирующем панэнцефалите (табл. 13). В продромальном периоде гепатита В возникают васкулиты и артриты, обус-ловленные циркулирующими иммунными комплексами, содержащими HBs-антиген и анти-НВв-антитела, и гломе-рулонефрити, связанные с гранулярными отложениями иммунных комплексов в ткани почек.

Таблица 13. Иммунокомплексная патология при вирусных инфекциях Инфекция Наличие иммунных комплексов в крови в тканях Гепатит В + + Инфекционный мононуклеоз -Ь -Ь Цитомегалия + 4- Лимфома Беркитта + + Геморрагическая лихорадка денге -Ь -Ь Подострый склерозирующий панэнцефалит + + В ядрах гепатоцитов при хроническом гепатите В регулярно обнаруживают как вирусные антигены, так и антитела класса IgG, которые проникают в клетку в результате нарушения проницаемости клеточных мембран. Основным антигенным компонентом является HBs- антиген, однако в иммунных комплексах обнаруживаются НВс- и НВе-антигены. При геморрагической лихорадке денге иммунные комплексы обусловливают усиленную репродукцию вируса путем взаимодействия с Fc-рецепто- рами моноцитов и активацию системы комплемента. При инфекционном мононуклеозе, лимфоме Беркитта и назофарингеальной карциноме обнаружены иммунные комплексы, содержащие аутоантитела. У больных цитоме- галией детей обнаружены циркулирующие иммунные комплексы и иммунные комплексы в мембранах почечных клубочков. При ряде вирусных инфекций иммунокомплексная патология лежит в основе патогенеза. Так, гибель мышей, внутриутробно зараженных вирусом лимфоцитарного хориоменингита, наступает впоследствии от иммуно- комплексного гломерулонефрита; та же причина гибели наблюдается при алеутской болезни норок. При других вирусных инфекциях иммунокомплексная патология явно не выражена, однако она также играет роль в патогенезе заболевания. Например, при полиовирусной инфекции формирование иммунных комплексов, фиксирующихся в стенках кровеносных сосудов, приводит к нарушению их проницаемости и способствует проникновению вирусных частиц через гематоэнцефалический барьер.

Сохранение инфекционной активности вируса в составе иммунных комплексов является одной из основных причин возникновения хронических форм вирусных инфекций. При этом создается порочный круг: длительно текущий патологический процесс наносит ущерб репарационным системам гомеостаза организма, что, в свою очередь, приводит к созданию условий для персистенции вируса или его компонентов.

ИНТЕРФЕРОН

А. Айзекс и Ж. Линдеман в 1957 г. обнаружили, что клетки, зараженные вирусом, вырабатывают особое вещество, угнетающее размножение как гомологичных, так и гетерологичных вирусов, которое они назвали интерфероном. В дальнейшем было показано, что существует много интерферонов и поэтому следует говорить о системе интерферона. Если иммунная система обеспечивает белковый гомеостаз и через него устраняет чужеродную генетическую информацию, то система интерферона непосредственно воздействует на чужеродную генетическую информацию, устраняя ее из организма на клеточном уровне, и тем самым обеспечивает нуклеиновый гомеостаз. Система интерферона тесно взаимодействует с иммунной системой.

Интерфероны являются белками с молекулярной массой, колеблющейся у разных интерферонов от 22- 103(мышиный интерферон) до 94* 103 (интерферон форели). Углеводные цепочки в молекуле fi- и 7-интерферона не обязательны для его активности.

Интерфероны закодированы в генетическом аппарате клетки. Гены для человеческого фибробластного интерферона располагаются во 2-й, 9-й и длинном плече 5-й хромосомы, а ген, регулирующий транскрипцию — в коротком плече той же хромосомы. Ген, детерминирующий восприимчивость к действию интерферона, локализован в 21-й хромосоме. Ген для а-интерферона располагается в 9-й хромосоме, для 7-интерферона — в 11-й хромосоме.

Система интерферона не имеет центрального органа, так как способностью вырабатывать интерферон обладают все клетки организма позвоночных животных, хотя наиболее активно вырабатывают его клетки белой крови.

Интерферон спонтанно не продуцируется интактными клетками и для образования его нужны индукторы, каковыми могут быть вирусы, бактериальные токсины, экстракты из бактерий и грибов, фитогемагглютинины, синтетические вещества — поликарбоксилаты, полисульфаты, декстраны, но наиболее эффективными индукторами интерферона являются двунитчатые РНК: двунитчатые вирусные РНК и двунитчатые синтетические сополимеры рибонуклеотидов (поли-ГЦ, поли-ИЦ) и др. Индукция интерферона происходит вследствие дерепрессии его генов.

Типы интерферонов. Известны три типа интерферонов человека: а-интерферон, или лейкоцитарный интерферон, который продуцируется лейкоцитами, обработанными вирусами и другими агентами; 6-интерферон, или фиброб- ластный интерферон, который продуцируется фиброблас- тами, обработанными вирусами и другими агентами. Оба эти интерферона принадлежат к типу 1. Более сильный у-интерферон, или иммунный интерферон, принадлежит к типу 2. Имеется несколько подтипов а-интерферона, и общее число их у человека доходит до 25. Сравнительная характеристика интерферонов человека приведена в табл. 14. Активность интерферонов измеряется в международных единицах (ME). Одна единица соответствует количеству интерферона, которое ингибирует репродукцию вируса на 50%.

При индукции интерферонов синтезируется два и более его типов. Так, при индукции интерферона на лимфобластах образуется 87% лейкоцитарного и 13% фибробластного интерферона, при индукции интерферона на фибробластах имеют место обратные соотношения. Между тремя типами интерферонов могут существовать синергические взаимодействия.

¦

Свойства интерферонов. Интерфероны обладают видот-каневой специфичностью. Это означает, что интерферон человека действует только в организме человека, но неактивен в организме других биологических видов. Конечно, барьеры видовой специфичности не абсолютны: интерферон человека проявляет некоторую активность в тканях человекообразных обезьян, а куриный интерферон в организме близких видов семейства куриных. Однако активность интерферона в гетерогенных организмах резко

Таблица 14. Сравнительная характеристика а-, р- и у-интерферонов человека Свойства Типы интерферона а Р 7 Количество подтипов >14 си—ай > 5 1 Клетки-продуценты Лейкоциты Фибробласты Т-лимфоциты Индукторы Вирусы, бак синтетиче Т-митогены, териальные ские мито- лектины, продукты,

полимеры, гены антигены Локализация в хромосоме 9-я 2-я; 5-я; 9-я 11-я Длина иРНК в килобазах 00

о

1

с-

© 00

о

1

с-

сГ ? Наличие нитронов нет 1 (Рг) 3 Количество аминокислот 166 166 Молекулярная масса 17 500—22 ООО 20 ООО 38 000—68 ООО Активность (МЕ/мг белка) 2,4 • 108 2,4- 108 >5- 107 Отношение к pH 2,0 Устойчив Устойчив Чувствителен

Чувствителен Отношение к температуре 56®С в течение 1 ч Устойчив Устойчив Гликозилирование — + + Антигенная специфичность + 4* + Наиболее выраженная биологическая актив-ность Противовирусная Иммуномоду-

лирующая снижается. Поэтому можно заключить, что интерфероны, появившиеся у позвоночных, эволюционировали вместе с хозяевами. Интерферон является относительно устойчивым белком и хорошо переносит кислую среду (pH 2,2), что используется для выделения его и очистки. Антигенные свойства интерферонов мало выражены, в связи с чем антитела к нему удается получить лишь после многократных иммунизаций.

Интерфероны не обладают специфичностью в отношении вирусов и действуют угнетающе на репродукцию различных вирусов, хотя разные вирусы обладают неодинаковой чувствительностью к интерферону. Чувствительность к нему обычно совпадает с индуцирующей активностью к интерферону. Наиболее часто применяемыми индукторами интерферона и тест-вирусами для его титрования являются рабдовирусы (вирус везикулярного стоматита), парамиксовирусы, тогавирусы. Продукция интерферона зависит также от характера применяемых клеток. Существуют клетки, дефектные по нескольким генам интерферона.

Интерфероны оказывают антивирусное, противоопухолевое, иммуномодулирующее и многие другие действия. Наиболее изучено их антивирусное действие, и именно на вирусных моделях выяснены биологические и другие свойства интерферонов.

Интерферон оказывает противоопухолевое действие при парентеральном введении в больших дозах, связанное с подавлением им цитопролиферативной активности. Добавление интерферона к культуре нормальных клеток сопровождается уже через 2 ч угнетением в них синтеза ДНК. При вируеиндуцированных опухолях интерферон угнетает репродукцию онковирусов и одновременно подавляет цитопролиферативную активность.

Интерферон является регулятором различных механизмов иммунного ответа, оказывая стимулирующее или угнетающее действие на иммунные реакции.

Механизм действия интерферона. Интерферон связывается с клеточными рецепторами, находящимися на плазматической мембране, что служит сигналом для дерепрессии соответствующих генов. В результате индуцируется синтез особой протеинкиназы PKds, которая присутствует в следовых количествах во всех клетках млекопитающих и активируется низкими концентрациями двунитчатой РНК, а в зараженных вирусами клетках — вирусными репликативными комплексами.

Протеинкиназа фосфорюшрует а-субъединицу иниции-рующего фактора трансляции eIF-2, и фосфорилирова- ние блокирует активность инициирующего фактора. В результате иРНК, связанная с инициирующим комплексом, не может связаться с большой рибосомальной субъединицей, и поэтому ее трансляция блокируется. Инициирующий фактор eIF-2 в одинаковой степени необходим для трансляции как клеточных, так и вирусных иРНК, однако преимущественно блокируется трансляция вирусных иРНК, связанных с вирусными двунитчатыми РНК-структурами, в результате локальной активации протеинкиназы.

В обработанных интерфероном клетках индуцируется синтез фермента — синтетазы, которая катализирует 2,5-олигоадениловую кислоту, переключающую действие клеточных нуклеаз на разрушение вирусных иРНК. Таким образом, вирусные иРНК подвергаются разрушению нуклеазами (рис. 34). Блокирование интерфероном стадии инициации трансляции и разрушение иРНК обусловливают его универсальный механизм действия при Синтетаза 2,5-ояигоадениловая

кислота Разрушение

свободной

вирусной

иРНН

Нарушение инициации трансляции

Фосфорилирование

Протеинниназа.

ЭИФ2А

Рис. 34. Механизм действия интерферона.

1— интерферон; 2— клеточный рецептор.

инфекциях, вызванных вирусами с разным генетическим материалом.

Применение интерферонов. Интерфероны применяются для профилактики - и лечения ряда вирусных инфекций. Их эффект определяется дозой препарата, однако высокие дозы интерферона оказывают токсическое действие. Интерфероны широко применяются при гриппе и других острых респираторных заболеваниях. Препарат эффективен на ранних стадиях заболевания, применяется местно, например путем закапывания или введения с помощью ингалятора в верхние дыхательные пути в концентрациях до 3- 104—5- 104 ед 2—3 раза в день. При конъюнктивитах интерферон применяют в виде глазных капель. Интерфероны оказывают терапевтическое действие при гепатите В, герпесе, а также при злокачественных новообразованиях. При этих заболеваниях назначают более высокие концентрации. Препарат применяется парентерально — внутривенно и внутримышечно в дозе 105 ед на 1 кг массы тела. Более высокие дозы оказывают побочное действие (повышение температуры, головная боль, выпадение волос, ослабление зрения и т. д.). Интерферон может вызвать также лимфопению, задержку созревания макрофагов, у детей — тяжелые шоковые состояния, у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями — инфаркт миокарда. Очистка интерферона значительно снижает его токсичность и позволяет применять высокие концентрации. Очистка осуществляется с помощью аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител к интерферону.

Генноинженерный интерферон. Генноинженерный лейкоцитарный интерферон получают в прокариотических системах (кишечной палочке). Биотехнология получения интерферона включает следующие этапы: 1) обработка лейкоцитарной массы индукторами интерферона; 2) вы-деление из обработанных клеток смеси иРНК; 3) получение суммарных комплементарных ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы; 4) встраивание кДНК в плазмиду кишечной палочки и ее клонирование; 5) отбор клонов, содержащих гены интерферона; 6) включение в плазмиду сильного промотора для успешной транскрипции гена; 7) экспрессия гена интерферона, т. е. синтез соответствующего белка; 8) разрушение прокариотических клеток и очистка интерферона с помощью аффинной хроматографии.

Получены высокоочшценные и концентрированые препараты интерферона, которые испытываются в клинике.