<<
>>

СПЕЦИАЛЬНЫЕ ТЕСТЫ

Определение метаболитов методом газовой хроматографии ([7]; см. также разд. 16.3.4)

Кислоты и спирты

Методики, описанные ниже, были разработаны для идентификации анаэробов, но их можно также исполь-зовать для аэробов и факультативно анаэробных микро-организмов.

1 мл культуральной среды, содержащей глюкозу или другие сбраживаемые углеводы, помещают в пробирку размером 12x75 мм и подкисляют 0,2 мл 50%-ной (по объему) H2S04; подкисленные образцы можно хранить для последующего анализа. Добавляют 0,4 г NaCl и 1 мл диэтилового эфира. Пробирку закры-вают корковой пробкой и ее содержимое перемешивают, осторожно переворачивая пробирку около 20 раз для перехода свободных жирных кислот в эфирную фазу. Смесь центрифугируют несколько минут и отделяют верхний слой эфира от слоя воды. Не следует удалять слишком много эфира, чтобы вместе с ним не попала вода. Эфирный слой помещают в другую пробирку раз-мером 12X75 мм и добавляют безводный СаС12 (4— 20 меш) в количестве, равном примерно объема эфира, для удаления растворенной воды. Отбирают 14 мкл и вводят в газовый хроматограф для анализа короткоцепочечных летучих жирных кислот и спиртов. Неино- кулированную среду подкисляют, экстрагируют и ис-пользуют в качестве контроля.

Пировиноградная, молочная, фумаровій и янтарная кислоты нелетучи, и поэтому для анализа методом газовой хроматографии их следует перевести в метиловые эфиры. 1 мл культуры помещают в пробирку размером 12X75 мм и добавляют 2 мл метанола и 0,4 мл 50%-ной H2S04. Вместо метанола можно добавить 2 мл мета- нольного раствора трехфтористого бора (BF3), который продается любой торговой организацией, поставляющей реактивы для хроматографии. Смесь нагревают 30 мин при 60 °С. В пробирку добавляют 1 мл воды и 0,5 мл хлороформа, плотно закрывают и осторожно переворачивают пробирку приблизительно 20 раз. Удаляют слой хлороформа (нижний слой) и вводят 14 мкл в газовый хроматограф.

Рекомендуется испо'льзовать газовый хроматограф с детектором по теплопроводности (ТП).

Можно использовать пламенно-ионизационный детектор (ПИД), однако при этом нельзя обнаружить муравьиную кислоту. Применяют колонку из нержавеющей стали, алюминия или стекла длиной 1,8 м и внутренним диамет-ром 6 мм. Колонку заполняют сорбентом Supelco SP-1000, 100—200 меш (Supelco Inc., Bellefonte, Ра.) или 5%-ным FFAP на хромосорбе G. И летучие жирные кислоты, и их метиловые эфиры анализируют на одной и той же колонке. Температура термостата колонок 135—145 °С. В качестве газа-носителя используют гелий, скорость потока которого равна 120 см3/мин. Если при-бор снабжен отдельными нагревателями для дозатора и детектора, их температуру устанавливают на 20—30 °С выше температуры колонки. Используют самописец на 1 мВ со скоростью движения бумаги 1,3 см/мин. Готовят стандарты для летучих кислот, спиртов и нелетучих кислот (разд. 20.4.18) и экстрагируют их так же, как пробы с культурой. Такие стандарты можно приобрести у любой торговой организации, поставляющей реактивы для хроматографии.

О наличии или отсутствии, а также о приблизительных количествах различных конечных продуктов метаболизма судят по профилю, который можно использовать для идентификации бактерий. Дополнительные количественные данные можно получить методом абсолютной калибровки, используя стандартные калибровочные кривые для каждой кислоты или спирта. Порядок элюирования спиртов и летучих жирных кислот из газохроматографической колонки таков: этанол, «-про-панол, изобутанол, «-бутанол, изоамиловый спирт, н-пентанол, уксусная, муравьиная, пропионовая, изомас- ляная, к-масляная, изовалериановая, «-валериановая, пзокапроновая, «-капроновая и гептановая кислоты.

Метиловые эфиры нелетучих кислот элюируются в следующем порядке: эфир пировиноградной, молочной,

щавелево-уксусной, щавелевой, метилмалоновой, малоновой, фумаровой и янтарной кислот.

Водород и метан

Образование водорода и метана определяют в культурах, выращенных в среде, содержащей глюкозу или другие сбраживаемые углеводы.

Пробирки с культурами закрывают резиновыми пробками и инкубируют.

После того как культуры вырастут, из пространства над культуральной средой отбирают пробы газа, вводя иглу шприца через резиновые пробки. Для этого пользуются 1- или 5-мл пластмассовым шприцем одноразового пользования с иглой длиной

см. Иглу вводят между резиновой пробкой и стенкой пробирки, а если понадобится, и через пробку под углом, позволяющим ей войти в газовую фазу над культуральной средой. Отбирают 0,7—1,0 мл газовой фазы и вводят в газовый хроматограф.

Газовый хроматограф должен быть оснащен детектором по теплопроводности. В качестве газа-носителя используют азот или аргон со скоростью потока 25— 30 см3/мин. Колонку из алюминия или нержавеющей стали длиной 1,83 м и диаметром 0,64 см заполняют силикагелем (N 12, 80—100 меш; Supelco Inc., Belleton- te, Pa.). Температура термостата колонки 25—ЗО °С; -если прибор оснащен раздельными термостатами дозатора и детектора, их устанавливают на ту же температуру, что и термостат колонки, или на несколько градусов выше. Стандарты для анализа газа продаются любой фирмой, поставляющей материалы для хроматографии. Для определения точки элюирования метана используют природный газ. В случае смеси водорода и метана водород элюируется из колонки раньше, чем метан.

Оптическое вращение молочной кислоты [7, 24]

К 10 мл культуры и 10 мл неинокулированной среды добавляют 0,2 мл 50%-ной (по объему) H2SO4. Концентрацию молочной кислоты определяют (в миллиэквивалентах на 100 мл) методом газовой хроматографии и используют для этого 1 мл подкисленной культуры (разд. 20.2.1). Для определения оптического вращения по описанному ниже методу минимальная концентрация молочной кислоты должна быть 1 мэкв/100 мл.

Приготовление растворов хлорной кислоты, буфера, лактатдегидрогеназы и NAD описано в разд. 20.4.8.

Б-( + )-Молочную кислоту и рабочий стандарт готовят следующим образом. К 5,0 мл подкисленной неино- кулированной среды добавляют 0,0296 г L-( + )-молочной кислоты (кальциевой соли) и 5,0 мл дистиллированной воды.

1,0 мл этого раствора добавляют к 1,0 мл хлорной кислоты. Центрифугируют и собирают надоса- дочную жидкость, которая является рабочим стандартом (1,0 мкмоль L-( + )-молочной кислоты в 0,1 мл).

К 1,0 мл подкисленной культуры добавляют 1,0 мл дистиллированной воды и 2,0 мл хлорной кислоты. Центрифугируют и отделяют надосадочную жидкость, которая служит образцом при определении оптического вращения.

К 1,0 мл подкисленной неинокулированной среды добавляют 1,0 мл дистиллированной воды и 2,0 мл хлорной кислоты. Смесь центрифугируют и отделяют надосадочную жидкость, которая является основным контрольным раствором.

Берут 7 стеклянных пробирок 12x75 мм. В пробирку 1 вносят 0,1 мл основного контрольного раствора. В пробирки 2—6 вносят соответственно 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 и 0,10 мл рабочего стандарта молочной кислоты. Добавляют в каждую пробирку соответственно 0,08; 0,06; 0,04; 0,02 и 0,00 мл основного контрольного раствора и доводят объем жидкости до 0,10 мл. В пробирку 7 вносят 0,10 мл испытуемого образца. В каждую из семи пробирок добавляют последовательно по 3,0 мл буфера и 0,03 мл раствора лактатдегидрогеназы. Затем добавляют 0,1 мл раствора NAD, закрывают каждую пробирку парафильмом и осторожно переворачивают несколько раз для перемешивания растворов (пробирки не встряхивать). Инкубируют при 30°С в течение 60 мин, точно выдерживая время с момента добавления NAD в 1-ю пробирку.

В каждой пробирке измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 340 нм. Если на используемом приборе нельзя снимать показания при этой длине волны, измеряют при длине волны, близкой к 340 нм, например в случае спектрофотометра Spectronic 20 (Bausch and Lomb, Inc., Rochester, N. Y.) устанавливают длину волны 366 нм. Пробирку 1 используют в качестве контроля при установке прибора на нуль. Снимают показания величины оптической плотности, точно соблюдая ту же последовательность, в которой добавляли NAD. Для снятия показаний пользуются одной и той же кюветой; после измерения содержимое кюветы выливают, кювету споласкивают и заполняют следующим раствором.

На миллиметровой бумаге строят график зависимости оптической плотности от количества L-( + )-молочной кислоты (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 мкмоль соответ-ственно в пробирках 1—6).

Калибровочную кривую про-водят с максимальной точностью. На основе этой стандартной кривой определяют количество L-( + )-мо-лочной кислоты в микромолях в испытуемой пробе (пробирка 7). Эту величину умножают на 4 и получают количество Ь-( + )-молочной кислоты в миллиэквива-лентах на 100 мл культуры. Вычисляют процент L-( + )- молочной кислоты по формуле:

мэкв ?-(-Т)-молочной кислоты (результат

ферментативной реакции) j QQ

мэкв молочной кислоты (общее содержание, определенное с помощью газовой хроматографии) в 100 мл

Системы комбинированного тестирования

В продаже имеется несколько удобных систем для быстрой идентификации различных групп бактерий, особенно сем. Enterobacteriaceae. Полную информацию по идентификации с помощью таких систем можно по-лучить от фирм-изготовителей. Там же можно получить бланки для фиксирования результатов: таблицы, систе-мы кодирования или характеристичные профили, раз-работанные для этих систем. Ниже дано краткое описа-ние некоторых систем, а также ссылки на литературу, из которой можно составить представление об их точности и надежности.

Система API 20Е для идентификации Enterobacterla- сеае и несбраживающих бактерий (Analytab Products, Plainview, NY 11803) состоит из пластмассовой пластинки с 20 вставленными в нее микропробирками, содержащими (в сухом виде) различные среды, с помощью которых можно провести 23 биохимических теста в течение 18—24 ч. Среды становятся пригодными для использования при добавлении в микропробирки разбавленной суспензии испытуемых микроорганизмов. Суспензию предохраняют от высыхания, добавляя воду в углубления в пластмассовой пластинке, в которую помещают пробирки. В некоторые микропробирки до-бавляют стерильное вазелиновое масло для предотвра-щения доступа кислорода. Оценка надежности системы дается в работах [16, 31, 40, 68-—70, 76, 78, 81].

Система API 20А для анаэробов (Analytab Products) похожа на систему API 20Е. Колонии бактерий суспен-дируют в среде для анаэробов и суспензию используют для разведения сухих сред в микропробирках в аэроб-ных условиях.

Затем пластинку с микропробирками по-мещают в анаэростат или анаэробный бокс и инкубиру-ют от 24 до 48 ч при 35—37 °С [62].

Система Entero-Set 20 для идентификации Entero- bacteriaceae (Fischer Scientific Co., Diagnostics Div., Orangeburg, NY 10962) похожа на систему API. Их отличие состоит в том, что при заполнении микропроби- рок первой системы бактериальной суспензией из них удаляется воздух. В некоторые пробирки добавляют масло, чтобы предотвратить доступ кислорода к среде.

Система Minitek для Enterobacteriaceae, несбраживающих бактерий, Neisseriaи анаэробов (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md 21030) состоит из пластмассовой пластинки с 12 лунками. С помощью специального устройства в лунки помещают диски, импре- гнированные субстратами. Набор дисков подбирают фирма-изготовитель или те, кто ими пользуется. С по-мощью автоматической пипетки со стерильным нако-нечником одноразового пользования в каждую лунку помещают суспензию испытуемой бактерии в бульоне Minitek. Некоторые лунки покрывают слоем масла. Вре-мя инкубации для представителей сем. Enterobacteria- сеае составляет от 18 до 24 ч, для несбраживающих бактерий — от 24 до 48 ч и для Neisseria —4 ч. Испарение в процессе инкубации предотвращают с помощью пластмассового увлажнителя. В случае анаэробных ор-ганизмов суспензию клеток в бульоне для анаэробов разливают в лунки с дисками и инкубируют в анаэрос- тате или анаэробном боксе в течение 48 ч [17, 40, 41, 49, 89].

Система PathoTec Rapid І-D для идентификации Еп- terobacteriaceae и других групп (General Diagnostics Div., Warner-Lambert Co., Morris Plains, NJ 07950) со-стоит из 10полосок, пропитанных реактивами для тестов на фенилаланиндезаминазу, лизиндекарбоксилазу, ути-лизацию малоната и т. д. Полоски помещают в пробирки с суспензией испытуемых микроорганизмов; в некото-рых случаях ими проводят по колониям клеток. Резуль-тат определяют приблизительно через 4 ч, за исключе-нием теста на оксидазу, когда результат получают через 30 с [40, 68, 69].

Система Enterotube для идентификации представителей сем. Enterobacteriacea (Roche Diagnostics, Nutley, NJ 07110) состоит из пробирки с 8 отсеками, заполненными различными агаровыми средами. Через отсеки проходит канал с тонким металлическим стержнем. Выступающим концом стержня касаются колонии и затем протягивают его через все отсеки, засевая таким образом различные среды. Некоторые среды для защиты от воздуха покрывают слоем воска. Результаты учитывают после инкубации в течение 24 ч [39, 63, 68, 69, 92].

Система Oxi/Ferm для идентификации несбраживаю-щих грамотрицательных палочек (Roche Diagnostics) похожа на систему Enterotube, но предназначена для несбраживающих организмов [31, 48, 71, 80].

Система Corning r/b Enteric Differential для идентификации представителей сем. Enterobacteriaceae (Corning Medical Microbiology Products, Roslyn, NY 11576) состоит из двух пробирок обычного размера с сужениями посередине, разделяющими их на 2 отсека. В пробирках находятся агаровые среды. Система позволяет определять 9 различных свойств, две дополнительные пробирки со средами позволяют осуществлять при необходимости еще 6 тестов. В агар вводят до дна иглу с бактериями (через сужение), а затем вынимают ее и инокулируют штрихом скошенную поверхность агара. Результаты определяют через 18—24 ч [59, 78, 86].

Система Corning N/F для идентификации окисляющих грамотрицательных бактерий (Corning Medical Microbiology Products), состоящая из двух пробирок со- средами (пробирки GNF и 42Р), позволяет проводить первую оценку по результатам 5 реакций через 18—24 ч. Последующие тесты осуществляют в круглых пластмассовых чашках (чашки UnLN/F-Tek) с углублениями, заполненными различными агаровыми средами. В них можно провести 12 дополнительных реакций, результаты которых регистрируют через 24—48 ч. Среды в лунках инокулируют каплей бактериальной суспензии.

Система Micro-ID для идентификации бактерий сем. Enterobacteriaceae (General Diagnostics Div., Warner- Lambert Co.) представляет собой пластинку с 15 тест- камерами, содержащими диски фильтровальной бумаги, пропитанной реактивами и субстратами. Содержимое камер инокулируют суспензией бактерий. Нанесение сверху слоя масла для защиты от кислорода не требуется. Результаты учитывают после инкубации при 37 °С в течение 4 ч [16].

Многоточечные инокуляторы

Широкое распространение имеющихся в продаже стерильных пластмассовых чашек для микротитрования (пластмассовых чашек с 96 миниатюрными лунками, каждая объемом около 0,2 мл) привело к развитию- микрометодов, позволяющих определять образование- кислот из углеводов, образование газов и другие биохи-мические реакции.

Многоточечный инокулятор можно изготовить самостоятельно, вставив острыми концами булавки из нержавеющей стали с 27-мм головками в заполненные- воском лунки или чашку для микротитрования [36]. Можно также вколоть булавки или штифты в деревянную, пластмассовую или металлическую основу в точном соответствии с лунками в чашке для микротитрования [37]. Металлический инокулятор обладает тема преимуществом, что его можно автоклавировать, однако другие инокуляторы можно с успехом «стерилизовать», опуская булавочные головки в спирт и затем выдерживая их 1—2 с в пламени головками вверх [36]. Чтобы «зарядить» инокулятор, его приводят в контакт с клетками, опуская на шаблонную пластинку для микротитрования, каждая лунка которой содержит отдельный штамм бактерий; при этом на каждой булавочной головке остается около 0,006 мл культуры. Затем инокулятор приводят в контакт с пластинкой для микротитрования, лунки которой заполнены бульоном с углеводом. При этом каждая лунка с бульоном инокулируется определенным штаммом бактерий, находящимся на отдельной булавочной головке. Инокулятор вновь опускают на шаблонную пластинку для «перезаряжения» и инокулируют вторую пластинку для микротитрования, лунки которой заполнены средами с другим углеводом и т. д. Для определения образования газа из углеводов каждую инокулированную лунку покрывают стерильной смесью, содержащей 1 часть амоджела (American Oil Со.) и 1 часть вазелинового масла [38]. Инокулирован- ные чашки закрывают крышками и инкубируют. Обра-зование кислоты определяют по изменению цвета pH-индикатора, помещенного в среду. Накопление пу-зырьков под верхним слоем масла свидетельствует о газообразовании.

Заполнение лунок чашки для микротитрования стерильной средой можно значительно облегчить, пользуясь многоканальной автоматической пипеткой (Cooke Engineering Co., Alexandria, Va.) или другим подобным устройством. Можно самостоятельно изготовить приспособление, описанное, например, Уилкинсом и др. [96]. Для этого берут иглы № 18 для подкожных инъекций, снимают с них наконечники и вынимают мандрены. Затем иглы припаивают медно-цинковым припоем к отверстиям на трубке из нержавеющей стали длиной 13,5 см и диаметром 7 мм так, чтобы расстояния между иглами были равны расстояниям между лунками пластинки для микротитрования (рис. 20.2). Один конец трубки оставляют открытым, а к другому концу припаивают медно-цинковым припоем соединитель типа Люер-Лок. После стерилизации всего устройства этот соединитель прикрепляют с соблюдением правил асептики к стерильному автоматическому пипеточному шприцу типа Корнуолл (Becton, Dickinson and Co., Rutherford, N.J.), снабженному стерильным шлангом для заполнения (рис. 20.2). Конец шланга погружают в колбу со стерильной средой и заполняют шприц, несколько раз оттягивая поршень. Затем восьмиигольчатую гребенку,

Рис. 20.2. Устройство для одновременного заполнения восьми лунок пластинки для микротитроваяия. 1 — трубка из нержавеющей стали;

— иглы для подкожных инъекций № 18, припаянные к трубке;

— пластинка для микротитроваиия с лунками; 4 — соединитель- типа Люер-Лок, припаянный к концу трубки; 5 — заполняющая трубка, присоединенная к шприцу типа Корнуолл; 6 — цилиндр и поршень шприца. Нажимая на поршень, одновременно заполняют стерильной средой 8 лунок.

з Л

приготовленную таким образом, устанавливают над рядом из восьми лунок на пластинке для микротитрования и надавливают на поршень шприца, вливая одновременно по 0,2 мл среды в каждое углубление. Таким же способом заполняют все остальные ряды лунок на пластинке. Устройство промывают стерильной водой (или кипятком, если в лунки вносят агаровую среду) я затем заполняют другой средой, которую предстоит внести в лунки.

С помощью пластинок для микротитрования можно- проводить и другие биохимические тесты. Например, тест на индол проводят, добавляя 2 капли реактива Ко-вача в культуры, находящиеся в лунках, а для прове-дения реакции Фогес—Проскауера в культуру добав-ляют 1 петлю а-нафтола и затем 1 петлю КОН [37]. Однако некоторые тесты нельзя проводить с помощью- пластинок для микротитрования. Например, при опре-делении уреазы аммиак, образуемый уреазоположи- тельными микроорганизмами, может диффундировать в- соседние лунки и давать ложноположительный ре-зультат. Для засева поверхности диагностического агара в обычных чашках Петри можно применять многоточечные инокуляторы [36, 57]. С помощью таких инокуля- торов с заостренными штифтами или булавками можно в случае необходимости инокулировать бактерии прокалыванием агара [65]. Однако при посеве различных штаммов в одной чашке может происходить чрезмерное разрастание или взаимное перекрывание колоний. Эта проблема исчезает при использовании чашек Петри, разделенных на отсеки (Dynos Plastics Ltd., Surbiton, Surrey England) [57], миниатюрных формочек для получения кубиков льда [36] или пластинок для микротитрования [37, 96]. На последних можно приготовить маленькие косячки, например косячки агаровой среды с тремя сахарами и железом, и инокулировать их с помощью прокалывающего инокулятора [37].

При многоточечной инокуляции анаэробов в лунки пластинок для микротитрования разливают стерильные полужидкие среды и инкубируют их с закрытыми крышками в течение ночи при 37 °С для выявления посторонних бактерий, а также для подсушивания [95]. Пластинки помещают в анаэробный бокс с перчатками и оставляют на 2 дня для восстановления сред перед инокуляцией. Пластинки инокулируют с помощью прокалывающего инокулятора внутри бокса с перчатками. Хотя каждая пластинка имеет 96 лунок, инокулируют только 48 из них (в шахматном порядке), а 48 оставляют неинокулированными в качестве контрольных лунок для обнаружения изменений pH небиологического характера или возможной миграции подвижных бактерий из одной лунки в другую. После инокуляции каждую пластинку закрывают полоской стерильной нетоксичной пластмассовой ленты (Cooke Engineering Co.). Сначала ленту кладут на резиновую подставку липкой стороной вверх, а затем прижимают к ней перевернутую пластинку. Для того чтобы каждая лунка была плотно закрыта, по пластинке проводят роликом. Для выхода газов во время роста над каждой лункой делают отверстие с помощью ленточного перфоратора. Пластинку инкубируют в течение 3 дней в анаэробном боксе. Кислотообразова- ние определяют с помощью тонкого pH-электрода (такого, например, как электрод S-30070-10, Sargent-Welch

Co., Skokie, 111.), который вводят в среду в каждую лунку. Можно не промывать электрод после каждой лунки, так как при каждом погружении остатки агара на кончике электрода перемещаются вверх [95].

Множественная инокуляция с помощью бархата

Метод множественной инокуляции с помощью бархата предназначен для определения потребностей в питании большого числа штаммов. Ниже описана методика, с помощью которой можно определить способность 267 штаммов псевдомонад к использованию 146 различных органических соединений в качестве источников углерода и энергии [88].

Готовят агаровую среду следующего состава: 40 мл буфера Na2HP04— КН2Р04 (1,0 М, pH 6,8); 20 мл

безвитаминной минеральной основной среды Хатнера (разд. 20.3.18); 1,0 г (NH4)2S04; 20 г агара и 940 мл дистиллированной воды. В среду добавляют 0,1—0,2% испытуемого источника углерода и разливают ее по чашкам Петри. Агар в стерильных чашках подсушивают инкубацией при 37 °С в течение 2—3 дней. Чашки хранят до применения (не больше 4—5 нед) в пластмассовых пакетах при комнатной температуре. Матричную чашку готовят, высевая на агаровую среду, содержащую 0,5% дрожжевого экстракта, методом «заплаток» (инокулируют лишь небольшие участки) до 23 различных штаммов бактерий. После того как появляются колонии, с помощью бархата методом отпечатков, впервые описанным Ледербергами [54], засевают вспомогательные чашки. См. также разд. 13.6.2. Согласно этому методу, кусочек стерильного бархата прикрепляют к цилиндрической болванке с диаметром, немного меньшим диаметра чашки Петри, и осторожно прижимают его ворсинками к агару в матричной чашке. Затем таким же образом прижимают его к стерильному агару в других чашках. В результате перепечатывания колонии во вспомогательных чашках имеют точно такое же рас-положение, как и в матричной. От одной матричной чашки можно инокулировать 9 вспомогательных чашек. После появления признаков роста культур во вспомогательных чашках каждую из них используют для посева методом отпечатков в 9 других чашек с различными соединениями углерода, а затем в последнюю чашку с агаром, содержащим дрожжевой экстракт, для того чтобы проверить, имел ли место перенос всех штаммов. Чашки просматривают через 48 и 96 ч и результаты учитывают следующим образом: рост не лучше чем на контрольной чашке без источника углерода 0; хороший рост +; рост недостаточно хороший, однако существенно лучший чем на контрольной чашке ±; запоздалый рост нескольких колоний на месте мазка, которые предположительно возникли из мутантов, содержавшихся в инокуляте +М. Когда штаммы с сильно различающимися потребностями в питательных веществах высевают на одну чашку, может происходить перекрестное питание (за счет диффузии питательных веществ, продуцируемых одним штаммом, к примыкающим колониям других штаммов, что приводит к ложноположительной реакции) или один штамм может мешать росту другого. Поэтому после первоначального произвольного скрининга проводят второй скрининг, используя иное расположение колоний штаммов в матричной чашке.

Ауксанографический метод определения потребностей в питательных веществах

Расплавленную основную агаровую среду (при температуре 45—50° С) без источников углерода инокулируют отмытой суспензией испытуемого микроорганизма. Погружают края стерильных дисков из фильтровальной бумаги в стерильные растворы различных соединений углерода, позволяя жидкости импрегнировать диск. Эти диски можно сразу же положить на поверхность иноку- лированного агара в чашках, или же их можно хранить до использования в высушенном состоянии в стерильном контейнере. Диски располагают по краю чашки Петри (3—4 диска на чашку) или на больших поверхностях инокулированного агара (например, разлитого в пирексовые противни) на соответствующем расстоянии друг от друга. После инкубации проверяют наличие зон роста (помутнения) вокруг диска, свидетельствующих об использовании источника углерода. В некоторых случаях рост наблюдается только в виде линии между двумя дисками; это, по-видимому, означает, что организму требуются оба источника углерода. Рост по всей поверхности агара может быть вызван слишком густым посевом; в таком случае следует применять более разбавленный инокулят.

Нитрогеназная активность и азотфиксация (см. также разд. 17.6.10)

Метод, основанный на восстановлении ацетилена, позволил относительно легко по сравнению с методами включения 15N2определять нитрогеназную активность у бактерий, хотя методы включения 15N2по-прежнему остаются наиболее точными. Принцип метода восстановления ацетилена основан на способности нитрогеназ- ного комплекса ферментов восстанавливать ацетилен до этилена. Испытуемый микроорганизм культивируют в условиях, способствующих образованию нитрогеназы. Затем в сосуд с культурой добавляют газообразный ацетилен и после инкубации определяют образование этилена. Контрольные культуры на средах, содержащих ионы аммония, которые подавляют синтез нитрогеназы (за исключением Rhizobitim),образуют мало этилена или вообще не образуют его. Подробное описание метода восстановления ацетилена и его применения приводится в ряде работ [4, 5, 11].

Важно культивировать организмы в условиях, способствующих синтезу нитрогеназы. Это требует использования среды, не содержащей связанного азота, но содержащей нужный источник углерода и энергии, а также источник молибдена. Кроме того, необходимо обеспечить соответствующую газовую атмосферу. Для анаэробных организмов, таких, как Clostridium pasteu- rianum,необходимы анаэробные условия. Анаэробные условия благоприятны также для синтеза нитрогеназы у факультативных анаэробов, таких, как Klebsiella. Многие азотфиксаторы для роста и образования энергии нуждаются в кислороде, но устойчивость к кислороду для роста в условиях азотфиксации у таких организмов сильно различается. Например, Azospirillumлучше всего растет в условиях азотфиксации при концентрации кислорода около 1% и не растет вообще на воздухе (21% кислорода), тогда как Azotobacter является аэротолерантным. Однако даже аэробные азотфиксаторы обычно лучше фиксируют азот при более низком уровне кислорода, чем в воздухе.

Аэробные азотфиксаторы

Микроорганизмы выращивают на (или в) солевой среде (твердой или жидкой) в пробирках, закрытых ватными пробками, или в пенициллиновых флаконах. Примером такой среды является среда Бёрка для Azotobacter(разд. 20.3.9). Иногда для инициации роста желательно добавлять небольшое количество источника связанного азота (например, 0,0001—0,005% дрожжевого экстракта). В конце инкубационного периода ватную пробку заменяют стерильной пенициллиновой пробкой. Газообразный ацетилен собирают (внимание: огнеопасно!) в вытяжном шкафу следующим образом [11]. В пробирку, наполовину заполненную 15 мл воды, добавляют кусочек (около 1 г) карбида кальция. Пробирку немедленно закрывают пробкой с отверстием, через которое она с помощью резиновой трубки соединяется с химическим стаканом с водой, куда погружен конец трубки. После того как ацетилен вытеснит воздух из трубки, но все еще продолжает образовываться, его отбирают из трубки шприцем с иглой для подкожных инъекций № 26. Ацетилен вводят в сосуд с культурой через резиновую пробку до концентрации 10% (по объему). Через различные промежутки времени инкубации отбирают шприцем пробы газа по 1 мл из сосуда с культурой и проверяют наличие этилена методом газовой хроматографии (см. ниже).

Факультативно анаэробные и анаэробные бактерии

Очищенный от кислорода и пропущенный через фильтр газообразный азот пропускают через стерильную культуральную среду, помещенную в пробирки, и одновременно инокулируют среду. Пробирки закрывают стерильными пенициллиновыми пробками. Для факуль-тативно анаэробных бактерий, таких, как Klebsiella,

строго анаэробные условия не обязательны, так как клетки сами могут использовать небольшие остаточные количества кислорода и создавать высокоанаэробные условия. Примеры сред приведены в разд. 20.3.35 (для Klebsiella),20.3.13 (для Clostridium pasteuria- пит) и 20.3.16 (для Bacillus) .

:i

Можно также использовать пробирки Панкхурста объемом 40 мл (Asteli Laboratory Service Co., Ltd.,

London S.E. 6, England)

Рис. 20.3. Пробирка Панкхурста.

1—большая пробирка (1,9Х Х15,7 см) с культурой;

— соединительная трубка

(0,8X1,8 см) с непоглощающей ватой в качестве фильтра для газа;

— меньшая пробирка (1,9х

Х6,0 см) с гигроскопической ватой для щелочного пирогаллола.

[23]. Пробирка Панкхурста (рис. 20.3) состоит из двух пробирок (одна из которых больше, а другая меньше по размеру) и горизонтальной соединительной трубки, заполненной несорбирующей ватой в качестве фильтра для газа. В большую пробирку наливают 5—10 мл культуральной среды и временно закрывают ватной пробкой. Среду стерилизу-ют автоклавированием. Охлажденную среду инокулируют и с соблюдением правил асептики закрывают обе пробирки стерилизованными пенициллиновыми пробками. Через систему пропускают газообразный азот (иногда в этой стадии нет необходимости; см. [11]), вставив в обе пробки иглы для подкожных инъекций, одну — для ввода газа, другую — для вывода. После пропускания газа иглы убирают и в меньшую пробирку вносят 0,75 мл насыщенного раствора пирогаллола, а затем 0,75 мл раствора, содержащего 10% (вес/объем) NaOH и 15% (вес/объем) К2СО3.

Эти добавки впитываются небольшим кусочком сорбирующей ваты, заранее помещенной на дно меньшей пробирки, как показано на рис. 20.3. Добавленные химические вещества реагируют с остаточным кислородом, и удаляют его, благодаря чему создаются анаэробные условия. Если не пропускать азот через пробирку Панк- хурста, то для создания анаэробных условий требуется 2—3 ч, и в этот период для замещения удаленного- кислорода следует добавить приблизительно 12 мл молекулярного азота [11].

После того как культура вырастет, через резиновую пробку вводят ацетилен до конечной концентрации 10% (по объему). Культуру инкубируют в течение различных периодов времени и шприцем отбирают пробы газа по 1 мл для газохроматографического обнаружения этилена.

Бактерии, нуждающиеся в микроаэробных условиях для азотфиксации

Полужидкие безазотные среды успешно используются для демонстрации восстановления ацетилена азот- фиксирующими спириллами (см., например, разд. 20.3.3, где описана среда для Azospirillum). Полужидкие среды можно инкубировать на воздухе, так как они обеспечивают градиент концентрации кислорода, направленный от поверхности среды вниз. Это позволяет микроаэрофильным бактериям расти при любом наиболее подходящем для них уровне содержания кис-лорода. Рост начинается в виде узкой полоски или тон-кой пленки в нескольких миллиметрах ниже уровня поверхности среды; по мере увеличения числа клеток пленка уплотняется и приближается к поверхности среды. Пробирку не следует встряхивать во время роста или последующего добавления ацетилена, так как при любом повреждении пленки может открыться доступ кислорода к клеткам и инактивироваться нитрогеназа.

После начала роста в пробирке или флаконе ватную пробку заменяют пенициллиновой и впрыскивают ацетилен до конечной концентрации 10% (по объему). После инкубации в течение различных периодов времени отбирают пробы газа до 1 мл для газохроматографического анализа (см. ниже).

Газовая хроматография (см. также разд. 16.3.4)

Используют газовый хроматограф с водородным пламенным детектором. Обычно длина колонки составляет 1,5 м, внутренний диаметр 2 мм. Колонку заполняют порапаком R или N (Waters Associates Inc., Framingham, Mass.). Температура термостата колонки равна +50°С, причем ее можно поддерживать при лю-бом постоянном значении в интервале от комнатной температуры до 80° С. В качестве газа-носителя используют азот со скоростью потока ~50 см3/мин. Калибруют хроматограф имеющимся в продаже этиленом (степень чистоты 99%), разбавленным азотом.

Пробы газа и стандарты этилена вводят пластмассовым шприцем одноразового пользования. Поскольку на пластмассовой поверхности шприца остается небольшое количество этилена, после использования его выбрасывают и заменяют новым. Резиновые пенициллиновые пробки также могут загрязняться этиленом, их тоже нельзя использовать повторно.

На пенициллиновых пробках или резиновой прокладке дозатора газового хроматографа могут оставаться отверстия от игл. Во избежание этого кончик иглы загибают, как показано на рис. 20.4.

В процессе хроматографирования проб газа, содержащих и ацетилен, и этилен, ацетилен выходит из ко-

Рис. 20.4. Схематическое изображение кончика иглы шприца. Справа показано, как надо загнуть ело, чтобы при прохож-дении иглы через пробки от пенициллиновых флаконов или резиновые пе-регородки в них не оставались дырки.

лонки с порапаком позже, чем этилен. Нельзя вводить в хроматограф новые пробы, пока ацетилен от предыдущей пробы не пройдет через колонку.

20.2.8. Серология

Тесты на агглютинацию

на предметных стеклах

Предпочтительно использовать предметные стекла с керамическими кольцами (ободками) диаметром около 14 мм. Однако можно применять и стеклянные пластинки, разделенные на квадраты со сторонами по 2,5 см карандашом-стеклографом. Лиофилизованную антисыворотку разводят в соответствии с инструкцией фирмы- изготовителя. В одно из колец помещают каплю антисыворотки, а в другое — каплю физиологического раствора (0,85% NaCl) или нормальной сыворотки кролика. Выросшую культуру снимают петлей с поверхности агара и смешивают с каждой из капель до получения однородной клеточной суспензии без сгустков. Суспензия должна быть мутной, но не слишком густой. Пластинку покачивают с вращением в течение 1 мин для перемешивания клеток и жидкости, следя за тем, чтобы не расплескать суспензию, а затем проверяют ее визуально, рассматривая при ярком свете на темном фоне. Поло-жительная реакция: клетки, взаимодействующие с антисывороткой, образуют комки (т. е. суспензия выглядит гранулированной или, при сильном взаимодействии, даже «свернувшейся»). Сгустки лучше всего видны при слегка наклонном положении стекла, когда жидкость стекает к его нижней границе. В контрольном опыте с физиологическим раствором или нормальной сывороткой слипания клеток не происходит. Если же оно все- таки наблюдается, то это может свидетельствовать о том, что имеют дело с шероховатой формой (R) вместо гладкой (S).

Примечание: смесь бактерий и антисыворотки не должна высыхать, так как иначе невозможно наблюдать какие-либо признаки агглютинации. Если смесь все же подсыхает, то опыт повторяют с большим количеством антисыворотки.

Предостережение: после завершения опыта пластинку погружают в контейнер с дезинфицирующим раствором (например, с 1%-ным лизолом). Руки и стол моют дезинфицирующим раствором. Это важно, так как во время смешивания клеток с антисывороткой мелкие капельки могут разбрызгаться по стеклу и попасть на поверхность стола. Антисыворотка не убивает бактерии.

Преципитиновый тест для идентификации стрептококков

Культуру выращивают в 40 мл бульона Тодда — Хьюитта (разд. 20.3.33) в пластмассовых (поликарбо- натных или полипропиленовых) центрифужных пробирках объемом 50 мл с завинчивающимися крышками. После инкубации при 37 °С в течение 18—24 ч культуру центрифугируют в бакет-роторе при максимальной скорости. Надосадочную жидкость осторожно сливают в колбу Эрленмейера с дезинфицирующим раствором и протирают крышку центрифужной пробирки полотенцем, смоченным дезинфицирующим раствором. Следует убедиться в том, что вся надосадочная жидкость слита и взмучивания осадка во время сливания не было. К осадку добавляют 0,5 мл физиологического раствора (0,85 % NaCl) и суспендируют его, осторожно покачивая пробирку из стороны в сторону. Плотно завинчивают крышку и автоклавируют 15 мин при 121 °С. Снова центрифугируют при максимальной скорости, чтобы осадить автоклавированные клетки. Стараясь не взболтать осажденные клетки, переносят большую часть над- осадочной жидкости с помощью пастеровской пипетки в маленькую пробирку. Жидкость должна быть совершенно прозрачной; если она мутная, ее снова центрифугируют. В надосадочной жидкости содержатся растворимые антигены, экстрагированные из клеточных стенок стрептококков.

К антисыворотке добавляют воду согласно инструкции фирмы-изготовителя. В полученный раствор погружают в наклонном положении капиллярную трубку (с внутренним диаметром 0,7—1,0 мм и длиной 75— 90 мм) так, чтобы столбик сыворотки в ней достиг высоты 2—3 см. Закрыв противоположный конец указательным пальцем, капилляр извлекают из флакона с сывороткой и вытирают его внешнюю поверхность для удаления избыточной сыворотки. Затем конец капилляра с антисывороткой погружают в экстракт антигена и, убрав указательный палец, набирают 2—3 см раствора антигена. При продвижении экстракта вверх по капилляру между столбиками антисыворотки и антигена не должен попадать воздух. Закрывают конец капилляра указательным пальцем и капилляр вынимают. Наклоняют его почти горизонтально и, убрав палец, позволяют столбику жидкости двигаться к центральной части капилляра. У каждого конца трубки должно остаться не меньше 1 см воздуха. Один конец капилляра погружают в глину для лепки. Стирают с поверхности капилляра отпечатки пальцев и инкубируют 10—15 мин. Капилляр осматривают при ярком свете на темном фоне с помощью ручной лупы. Положительная реакция: появление легкого помутнения молочного цвета в центре капилляра на стыке антисыворотки и экстракта. При дальнейшей инкубации это помутнение увеличивается и на дне столбика жидкости выпадает осадок.

Реакция Квеллунга

Бульонную культуру наносят петлей на чистое предметное стекло и оставляют для высыхания на воздухе без подогревания. (Если в таком же мазке, окрашенном кристаллическим фиолетовым, присутствует более чем 15—25 клеток при просмотре в микроскоп с иммерсией, культуру следует разбавить, так как при слишком высокой концентрации клеток можно получить неточный результат.) К антисыворотке добавляют воду и наносят полученный раствор петлей на покровное стекло. Одну петлю 1%-ного водного раствора метиленового синего смешивают с антисывороткой и кладут покровное стекло каплей вниз на предметное стекло с высушенным мазком. Смотрят препарат в микроскоп с масляной иммерсией. Положительная реакция: капсулы вокруг окрашенных в синий цвет клеток становятся четко очерченными. Всегда следует проводить сравнение с контрольным препаратом, приготовленным с нормальной кроличьей сывороткой вместо антисыворотки. Если результаты теста отрицательные, необходимо повторить осмотр через 1 ч. Препарат предохраняют от высыхания, вы-держивая его во влажной камере или герметизируя по краю покровного стекла расплавленным васпаром (смесью из равных объемов петролатума и вазелиново-го масла).

Тест с использованием флуоресцирующих антител

Флуоресцирующую антисыворотку («конъюгат») и флуоресцирующую нормальную сыворотку растворяют в воде. Готовят несколько порций флуоресцирующей антисыворотки, разбавляя ее каждый раз вдвое (например, 1:5; 1:10; 1 : 20; 1 : 40; 1 : 80) в фосфатном буфере с добавлением NaCl [фосфатно-солевой буфер (ФСБ), см. разд. 20.4.17]. При каждом разведении антисыворотки с помощью метода окрашивания, описанного ниже, а также с помощью подходящего флуоресцентного (люминесцентного) микроскопа (разд. 1.4) определяют степень флуоресценции бактериальных клеток по шкале 0, 1 + , 2 + , 3 + , 4+ (максимум). Рабочее разведение антисыворотки составляет ’/2 максимального разведения, которое дает степень флуоресценции 4 + . Например, если максимальная степень флуоресценции 4+ достигается при разведении сыворотки 1 :20, то ра-бочее разведение равно 1 : 10. Эквивалентное разведе-ние флуоресцирующей нормальной сыворотки не долж-но давать флуоресценции.

Молодую бульонную культуру испытуемого микроорганизма центрифугируют и надосадочную жидкость сливают. Клетки суспендируют в ФСБ и вновь центрифугируют. К осадку добавляют небольшое количество ФСБ, чтобы получилась густая суспензия клеток. С помощью алмазного или карбидно-вольфрамового карандаша очерчивают круг диаметром размера предметного стекла. Стекло тщательно обезжиривают и внутри окружности делают мазок одной петлей бактериальной суспензии. Мазок высушивают на воздухе без нагревания, помещают предметное стекло на 1 мин в сосуд с 95%-ным этанолом, вынимают его и сушат на воздухе.

На мазок капают несколько капель рабочего раствора флуоресцирующей антисыворотки. Распределяют антисыворотку по мазку аппликатором, не касаясь мазка. Стекло препаратом вверх помещают в чашку Петри, к крышке которой прикреплен влажный кружок фильтровальной бумаги; такая чашка служит влажной камерой, в которой предотвращается высыхание антисыворотки. Инкубируют при 37 °С 15—20 мин.

Избыток антисыворотки сливают, наклоняя предметное стекло над фильтровальной бумагой. Затем стекло помещают в сосуд с ФСБ на 10 мин, периодически поднимая и опуская. Эту процедуру повторяют еще 2 раза, используя каждый раз сосуд со свежим ФСБ. После третьего погружения в ФСБ стекло опускают один раз в сосуд с дистиллированной водой для удаления ФСБ, сразу же промокают (не вытирают) фильтровальной бумагой и высушивают. На мазок наносят небольшую каплю забуференного глицерина (разд. 20.4.2) и накры-вают его покровным стеклом. Просматривают мазок в люминесцентный микроскоп (разд. 1.4) при большом увеличении с масляной иммерсией или без нее. Когда смотрят с иммерсией, применяют только нефлуоресци-рующее масло (разд. 1.5).

Параллельно с окрашиванием испытуемого микроорганизма по той же методике готовят две контрольные пробы. Одну с рабочим раствором флуоресцирующей антисыворотки и известной бактерией, а другую с испытуемым микроорганизмом и раствором флуоресцирующей нормальной сыворотки. Степень флуоресценции первой контрольной пробы составляет 4 + , во второй пробе не должно быть флуоресценции.

Примечание: при рассматривании мазков в люминесцентный микроскоп следует часто менять поле, так как при наблюдении одного и того же поля флуоресценция быстро затухает (приблизительно через 15 с). Наиболее яркая флуоресценция наблюдается в тот момент, когда в фокус объектива попадает новое поле.

Примечание: следует всегда пользоваться свежепри-готовленным рабочим раствором флуоресцирующей ан-тисыворотки. Неразведенная исходная сыворотка ста-бильна при хранении в холодильнике при температуре ниже +8 °С.

<< | >>
Источник: Ф. ГЕРХАРДТ и др.. Методы общей бактериологии — М.: Мир,1984. — 264 с.. 1984

Еще по теме СПЕЦИАЛЬНЫЕ ТЕСТЫ:

  1. Тесты
  2. 6.7.3. Тесты интеллекта
  3. 6.7.4. Тесты способностей
  4. 6.7.5. Тесты достижений
  5. Тематический апперцептивный тест
  6. 4.2 . Тесты для измерения интеллекта, их виды
  7. § 5. Невербальные тесты интеллекта
  8. § 2. Тесты креативности
  9. §3. Тестирование специальных способностей в нашей стране и за рубежом
  10. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ТЕСТЫ
  11. ВЫБОР ТЕСТОВ
  12. 3.2. Немного о тестах интеллекта
  13. Параклинические тесты для подтверждения смерти мозга
  14. 2.3. КРАТКИЙ ОБЗОР ПРОЕКТИВНЫХ ТЕСТОВ