Цикл репликации

Большинство опытов по изучению биохимии аденовирусной инфекции проводили при высокой множественности заражения (от 10 до 200 БОЕ/клетка), чтобы обеспечить синхронизацию инфекции и последующих биохимических событий в процессе репликации.

Цикл репликации аденовирусов разделяют на раннюю и позднюю фазы: последняя, по определению, начинается с момента запуска репликации ДНК. «Ранний» и «поздний» — удобные термины для многих этапов репликации, описываемых далее, однако их не следует понимать слишком буквально. Для некоторых процессов функциональные различия несколько размыты. Многие ранние мРНК синтезируются и во время поздней фазы инфекции, некоторые мРНК (например, для ДНК-связывающего белка) претерпевают изменения в лидерных последовательностях при переходе от ранней к поздней фазе инфекции, в то время как другие остаются неизменными [46]. Недавно было установлено, что основной поздний промотор в малых количест-вах транскрибируется во время ранней фазы инфекции, но при этом не происходит полной элонгации конечного первичного транскрипта до правого конца вирусной ДНК [47, 171].

Структурные белки аденовирусов синтезируются в основном в поздней фазе. Однако полипептиды IVa2 и IX, которые являются структурными компонентами, присутствующими в значительных количествах, синтезируются и в ранней фазе. Полипептиды IVa2 и IX транскрибируются с промоторов, отличающихся от промотора всех других поздних структурных белков. Первичные транскрипты ранней области 3 имеют свой уникальный промотор [49], однако в поздней фазе последовательности области 3 могут транскрибироваться с позднего промотора [44, 46, 49].

Аденовирусная инфекция оказывает глубокое воздействие на синтез макромолекул в клетках хозяина.

Синтез клеточной ДНК постепенно ингибируется после того, как начинается синтез вирусной ДНК, через 6—9 ч после заражения [128]. Механизм выключения синтеза клеточной ДНК не до конца ясен. Согласно одной из гипотез, для продолжения синтеза хроматиновой ДНК необходимо продолжение синтеза клеточных белков, в том числе гистонов. Таким образом, выключение синтеза клеточной ДНК может быть вторичным по отношению к выключению синтеза клеточных белков. Альтернатив-ная гипотеза основана на серии следующих опытов. Если синтез вирусной ДНК начинался во время фазы G1 клеточного цикла, то синтеза хозяйской ДНК в следующей фазе S не наблюдали. Однако если синтез вирусной ДНК в синхронизированных клетках совпадал с фазой S клеточного цикла, то уровень синтеза хозяйской ДНК не менялся на протяжении многих часов [120].

Литическин цикл аденовирусов группы С (Ad2 и Ad5) очень эффективен: синтезируется примерно 10 000 вирионов на зараженную клетку [103]. Таким образом, в течение одного вирусного цикла (32—36 ч) общее содержание ДНК и белка в клетке удваивается. Увеличение происходит практически только за счет вирусных макромолекул. Весьма незначительная часть клеток (около 15%), зараженных вирусом с высокой множественностью,

Время после заражения, ч

Рис. 28.4. Кинетика синтеза вируса и вирусных макромолекул. Представлены цикл инфекции Ad2 и кинетика синтеза типичных макромолекул. ДНК-связы- вающий белок 75К — пример ранних вирусных белков. (С любезного разрешения Marcel Dekker Inc. из [336а].)

делится [123]. На рис. 28.4 представлена примерная скорость синтеза вирусных макромолекул при 37 °С для аденовирусов группы С. Цикл для вирусов группы А несколько длиннее.

Прикрепление, проникновение, раздевание

Поскольку большинство частиц исходного вируса неинфек- ционны, изучение ранних событий при взаимодействии аденовируса с клеткой столь же сложно, как и при других вирусных инфекциях эукариотических клеток. Соотношение числа частиц к числу БОЕ варьирует от 11 : 1 до 2300: 1 для различных серотипов [105]. Эти цифры позволяют предположить, что многие частицы, видимые в электронном микроскопе или определяемые по распределению радиоактивной метки в различных клеточных структурах, не относятся к тому меньшинству вирусных частиц, которое обладает инфекционностью. Тем не менее проведено много интересных опытов, из которых следует, что фибрилла вируса прикрепляется к специфическим рецепторам на клеточной мембране [184]. По ингибированию фокусов флуоресценции [232], но не по подавлению бляшек [231] антитела к фибрилле нейтрализуют вирусную инфекцию.

Ранняя транскрипция

Ранняя транскрипция аденовирусов — сложная серия взаимосвязанных биохимических событий; ее можно определить как синтез вирусных РНК на проникшей в клетку аденовирусной ДНК-матрице до начала репликации вирусной ДНК. Ранние вирусные мРНК составляют менее 0,1% общей клеточной РНК. Однако вирусной ДНК [180, 300] комплементарны 5—18% поли- сомной мРНК Ранние транскрипты считываются с обеих цепей ДНК, что стало ясно из данных по разделению цепей с помощью синтетического poly(UG). Детальный анализ транскрипции разных областей аденовирусного генома стал возможен благодаря использованию рестрикционных эндонуклеаз. Сначала считали, что ранние цитоплазматические мРНК комплементарны четырем отдельным областям вирусной ДНК [264]. Впоследствии это число возросло до семи областей, начинающихся с шести промоторов [46, 283, 334] (рис. 28.5). Организация геномов одинакова для аденовирусов всех групп, и положение генов, кодирующих определенные функции, одинаково у всех изученных серотипов.

Методики картирования транскриптов

Многие первичные транскрипты и зрелые мРНК точно картированы с помощью гетеродуплексного анализа на электронном микроскопе.

IX

15К

58К

El А (10KV- _l'

28К г

54.4ZK

58.4ВК

LI

52.55К

Hz - (-)

5'

...5

100

-J

-J

10

87К-

80'

20

ЗО

40

50

60

70

90

ПК-

24К-

(-)

72K!

iva,

E4(Z1,19.17.13K)

- -9 E2a

E2B ( 105,75K)

Рис 28.5. Генетическая карта ранних белков, кодируемых Ad2, и их мРНК. Тонкие линии — мРНК, которые могут быть обнаружены на ранней стадии в отсутствие синтеза белков. Толстые линии соответствуют промежуточным мРНК- Эти мРНК экспрессируются в отсутствие репликации вирусной ДНК, т. е на ранней стадии, но на поздней стадии их больше. Стрелки указывают на З'-конец. Предполагаемые промоторные участки обозначены 3. Белок, кодируемый ранней мРНК, представлен рядом с этой мРНК. Обозначения белков, кодируемых определенной ранней областью, для которой структура мРНК еще не определена, даны в скобках. (С разрешения из [229].)

зовании этого метода для анализа поздних аденовирусных транскриптов был открыт сплайсинг [16, 48]. С помощью гетеродуп- лексного анализа можно определить места соединений при сплайсинге, а также длину нитронов. Для картирования использовали и биохимические методы. Например, проводили отжиг смеси денатурированной радиоактивно меченной аденовирусной ДНК и немеченых ранних мРНК. Гетеродуплексы (рис. 28.6) обрабатывали нуклеазой S1, гидролизующей любые одноцепочечные участки ДНК, или экзонуклеазой VII [17], гидролизующей только одноцепочечные свободные концы ДНК, и о длине нитронов и экзонов судили по подвижности образующихся фрагментов ДНК при электрофорезе в щелочных условиях.

Геномная локализация ранних транскриптов аденовирусов

Опыты по ультрафиолетовому картированию четко показали, что большинство ранних областей имеют собственные промоторы [18, 107а, 334], тогда как раньше считали, что ранние транскрипты аденовирусов являются продуктами нарезания единого транскрипта. УФ-инактивация максимальна для наиболее удаленных от промотора транскриптов, т. к. .повреждения ДНК кумулятивны. Однако после УФ-облучения ЕЗ-мРНК (которая должна была бы находиться на З'-конце единого транскрипта) не отличалась по эффективности синтеза от других Двухцепочечный фрагмент рестрикции ДНК

+

Ранняя мРнк AdZ

Отжиг в 80%-ном формамиде 0,4 мNaCL, 60-63°С Нуклеаза S1

Энзонуклеаза ШІ

Электрофорез В щелочном геле

Нуклеаза Si ЭкзонуклеаЗаТЩ начало —** — — Рис. 28.6. Схема биохимического эксперимента, поставленного с целью обнаружения сайтов сплайсинга. Гибриды, образующиеся между ранней мРНК и 32Р-рестрикционными фрагментами ДНК Ad2, гидролизуют или Sl-нуклеазой, или экзонуклеазой VII. Продукты анализируют электрофорезом в щелочном геле. Эта методика была разработана Берком и Шарпом [17]. (С разрешения из [302а].)

мРНК- Более поздние эксперименты по определению размеров и этапов процессинга ранних транскриптов подтвердили существо-вание нескольких ранних промоторов.

Последние данные позволили значительно расширить представления о четырех основных ранних транскриптах и выделить

«непосредственно ранний» (L1),«предранний» (Е1А), «задержанный ранний» (Е1В-Е4) и «промежуточный» (IVa2, IX) транскрипты (рис. 28.5). L1обозначен в соответствии с номенклатурой, принятой для поздних (L)генов, поскольку он впервые обнаружен как поздний транскрипт и синтезируется в поздней фазе в значительно больших количествах, чем в качестве непосредственно раннего транскрипта (см. ниже). Прежде всего мы остановимся на классических ранних участках, а также ставшем недавно известным транскрипте 2В, который в некоторых публикациях обозначают как область V. Ген, кодирующий ДНК-свя- зывающий белок и обозначавшийся ранее как область 2, теперь обозначают как область 2А. Более подробно все новые транскрипты, синтезирующиеся до начала репликации вирусной ДНК, будут рассмотрены в разделе «Регуляция экспрессии ранних генов аденовирусов». Цепь, транскрибируемая слева направо (г), содержит участки Elи ЕЗ от 1,3 до 11,2 и от 76,6 до 86,2 ед. карты соответственно. Домен Е1, который разделяют на Е1А (от

до 4,5 ед. карты) и Е1В (от 4,6 до 11,2 ед. карты), представляет особый интерес, так как он кодирует трансформирующие функции аденовирусов ,[260]. Е1А может трансформировать клетки и в отсутствие Е1В, но происходящая при этом трансформация характерна только для клеток перевиваемых линий, но не для первичных культур [308]. Вероятно, именно Е1В ответствен за трансформацию, однако на этот вопрос пока трудно ответить однозначно, поскольку ген Е1А осуществляет регуляцию всех других ранних аденовирусных генов. Для эффективной транскрипции Е2А, Е2В, ЕЗ и Е4 необходим активный транскрипт Е1А [171] или, как обсуждается ниже, 'манипуляции с клетками, позволяющие обойти функцию El А [210]. Регулирующую функцию Е1А активно исследовали и выделили много мутантов по области Е1А/Е1В [111, 142, 268]. Удалось показать, что продукт гена Е1А имеет структуру, сходную с онкогенными полипептидами туе и myb [242}.

/-Цепь, считываемая справа налево, кодирует Е4 (от 96,8 до

ед. карты), Е2А (от 67,9 до 61,5 ед. карты) и Е2В (от 29 до 14,2 ед. карты). Е2А кодирует ДНК-связывающий белок, существенный не только для репликации, но и для модуляции транскрипции, особенно области Е4 [110, 212]. Промотор мРНК Е2А изменяется при переходе от ранней фазы инфекции к поздней и может начинаться со столь отдаленных позиций, как 87 или 99 ед. карты. Транскрипты Е2В и Е2А имеют общие лидерные последовательности и экспрессируются координированно, но количество первого примерно в 100 раз меньше, чем второго [77, 283]. Из-за малых количеств мРНК Е2В этот очень важный участок, кодирующий 140К-ДНК-полимеразу (от 22,8 до 14,2 ед. карты) [1, 85, 177] и 80К-предшественник концевого белка (от

до 23,2 ед. карты), долго не удавалось обнаружить [274J. Продукты генов Е2Аи Е2В и их функции будут подробно обсуждаться в разделе «Синтез ДНК аденовирусов in vitro».

Промоторы, кэп-структуры, сплайсинг, присоединение poly(A)

Ранние и поздние аденовирусные мРНК синтезирует клеточная РНК-полимераза II. Количество ранних мРНК определяется рядом факторов, причем изменение множественности заражения от 1 до 100 БОЕ/клетка оказывает на синтез ранней мРНК значительно меньшее влияние, чем на синтез вирусной ДНК [17, 78]. Роль хозяйской РНК-полимеразы II в синтезе аденовирусных мРНК была доказана в экспериментах с а-аманитином — специфическим ингибитором данного фермента [240]. Недавно ее основная роль была подтверждена в опытах in vitro [193, 326].

Наиболее существенной для эффективной транскрипции El А является последовательность от —28 до —38 ед. карты выше сайта кэпирования El А [222, 223]. Эта область содержит после-довательность ТАТТТАТА, сходную с последовательностью Гольдберга — Хогнесса. Делеции в ней уменьшают уровень синтеза мРНК Е1А в 5—10 раз. Основной сайт кэпирования El А расположен у нуклеотида 498, который находится на 31 нуклеотид ниже ТАТА-последовательности [11]. В случае делеции в сайте ТАТА возможно использование других сайтов кэпирования. Например, нуклеотиды, расположенные на 230, 185 и 165 нуклеотидов выше, чем основной сайт кэпирования, могут служить альтернативными, но менее эффективными сайтами кэпирования [221]. После начала репликации ДНК обнаруживаются и другие минорные сайты кэпирования мРНК Е1А, которые не функционируют в присутствии цитозинарабинозида — ингибитора синтеза ДНК. Последовательность кэпа El Am7Gppp(m6)AniC(m> UCUUGp отличается от последовательности кэпа Е1В, и не исключено, что для каждой ранней мРНК существует своя последовательность [116]. Обозначение (ш) указывает на частичное метилирование.

В настоящее время обнаружено восемь различных кэпов. Среди них один для области Е4 — необычный, начинающийся с Um, т. е. с пиримидина вместо пурина [115]. Первый кодон ATG гена El А расположен в позиции 62—64 по отношению к сайту кэпирования, а потенциальный сайт связывания рибосом — между нуклеотидами 22 и 32. Недавние эксперименты с использованием вириона с точечной мутацией на З'-конце мРНК в сайте нормального расщепления и полиаденилирования Е1А позволяют предположить, что процессы расщепления и полиаденилирования разобщены [204а]. Если U в олигонуклеотиде AAUAAA превращали в G, то расщепление в положении 1630 уменьшалось более чем в 10 раз, что приводило к сквозному считыванию Е1В. Все молекулы, которые были расщеплены, были полиаденилирова- ны. Однако мутант, у которого расщепление произошло в положении 1605, не был полиаденилирован, но был сплайсирован. Таким образом, полиаденилирование не обязательно для сплайсинга. Эти результаты, полученные в опытах с использованием мутантов, приводят к тем же заключениям, что и результаты* полученные с применением кордицепина — аналога аденозина. Транскрипты, лишенные poly (А), в цитоплазме отсутствуют, что* вероятно, обусловлено блокированием их транспорта. Нельзя также полностью исключить предположение, что они достигают цитоплазмы, но затем очень быстро гидролизуются.

Регуляция экспрессии ранних генов аденовирусов

Сложный процесс регуляции экспрессии ранних генов аденовирусов активно изучается во многих лабораториях. Согласна современным представлениям, он включает несколько стадий* центральной из которых является экспрессия Е1А. Участок Е1А, который также называют предранним, регулирует накопление мРНК Е1В, Е2, ЕЗ и Е4, но мРНК Е1А — не первый вирусный транскрипт, появляющийся в зараженных клетках. Многие опи-санные ниже исследования были проведены с использованием ингибиторов синтеза ДНК или белков. Применение этих ингибиторов открывает широкие возможности в изучении экспрессии вирусных генов.

Известно, что при добавлении к клеткам, зараженным аденовирусом, циклогексимида увеличивается включение радиоак-тивной метки в ранние РНК, причем показано, что радиоактивность действительно отражает увеличение количества специфических мРНК [52]. Влияние, оказываемое циклогексимидом на синтез ранних мРНК, позволяет предположить, что в норме существует клеточный репрессор, ингибирующий экспрессию ранних генов [32, 65]. В процессе изучения этого белка-репрессора было исследовано большое число мутантов, имеющих изменения в области Е1А [19, 142]. При изучении этих мутантов были представлены убедительные доказательства того, что El А действительно регулирует экспрессию Е1В, Е2А, ЕЗ и Е4. Поскольку существовало предположение, что регуляция экспрессии других ранних генов происходит с помощью полипептида — продукта гена Е1А, усиление транскрипции под действием циклогексимида выглядело парадоксальным. Чтобы прояснить ситуа- цию, был поставлен ряд опытов. Поскольку циклогексимид ингибирует синтез белков не более чем на 97%, был использован анизомицин (100 мкМ), ингибирующий на 99,6%. При этом исходили из того, что остаточный уровень синтеза обеспечивает продукцию небольшого количества каталитического полипептида [171]. Оказалось, что анизомицин подавляет синтез всех известных мРНК, в том числе мРНК Е1А. Тем не менее обнаружено два новых вида мРНК — РНК для белка 13,5К, кодируемого участком между 17,0 и 21,5 ед. карты, и Ll-мРНК для позднего белка 52К—55К, кодируемого между 29 и 34 ед. карты (рис. 28.5) [1]. Раньше считали, что это районы исключительно поздних транскриптов. Транскрипты L1содержат поздний, состоящий из трех частей лидер (16,4; 19,6 и 26,6 ед. карты); некоторые из них содержат еще и лидер і(от 21,5 до 23,0 ед. карты) (см. ниже раздел «Поздняя транскрипция»). Эти тве области, обозначенные как «непосредственно ранние», не зависят от функции Е1А, поскольку их обнаруживают после заражения клеток делеционным мутантом по Е1Аdi 312. Из пяти групп поздних транскриптов L1расположен ближе всего к трем лидерным участкам. Никакие другие поздние транскрипты во время ранней фазы инфекции не обнаружены. При уменьшении концентрации анизомицина или сдвиге момента его внесения от 30 мин до за-ражения на разные сроки после него наблюдали последовательное появление других транскриптов. Синтез Е1А был менее подавлен, чем синтез других транскриптов, и его обозначают как «предранний». Синтез «задержанных ранних» транскриптов зависит от продуктов Е1А. Согласно данным других авторов, области Е2 и ЕЗ более чувствительны к действию анизомицина, чем области Е1А или Е4 [267]. Наиболее чувствительными к действию ингибиторов синтеза белка оказались гены, классифицированные как «промежуточные». Два из них кодируют полипептиды IX и IVa2(9,8—11,2 и 16,1—11,1 ед. карты соответственно). Синтез белков IX и IVa2начинается на ранней стадии инфекции и ускоряется на поздней. Среди непосредственно ранних генов L1 весьма устойчив к действию анизомицина (500 мкМ), тогда как ген 13,5К-белка более чувствителен и при концентрации 500 мкМ анизомицина ингибируется. Уровни экспрессии гена L1и других ранних генов на ранней стадии инфекции соизмеримы, однако на поздней стадии уровень экспрессии L1значительно увеличивается. Обнаружение ранней экспрессии позднего гена L1крайне удивило исследователей. Вместе с тем с помощью этого явления можно попытаться объяснить аномальные явления, обнаруживаемые в аденовирусных системах транскрипции in vitro. Эти системы (более подробно см. разд. «Поздняя транскрипция») работают при использовании экстрактов незараженных клеток, в которые добавлена РНК-полимераза II [193, 326]. Ранее считали, что in vivo поздние транскрипты не экспрессируются до тех пор, пока не накопятся некоторые продукты ранних генов. Поэтому ожидали, что in vitro необходимы продукты вирусных генов. Новые данные о том, что L1экспрессируется как непосредственно ранний ген, позволяют обойтись без постулирования таких продуктов. Поскольку поздние области L4и L5никогда не экспрессируются на ранней стадии инфекции, а минимальная экспрессия L2и L3может быть артефактом или результатом случайного считывания, был предпринят поиск (в районе 39 ед. карты) факторов, регулирующих терминацию или ограничивающих элонгацию поздних аденовирусных мРНК в ранней фазе инфекции.

Представление о последовательной экспрессии ранних транскриптов и ее модуляции под действием ингибиторов синтеза белка привело к предположению о существовании факторов* позитивно и негативно влияющих на транскрипцию аденовирусов. Была проведена большая серия опытов, основанных на концепции о существовании клеточного репрессора, который препятствует транскрипции областей Е1В-Е4 [209]. Функция белка Е1А в этом случае заключается либо в связывании с репрессо- ром, либо в ингибировании синтеза последнего. Циклогексимид также может подавлять синтез репрессора. Результаты исследований с мутантами, например di312 с делецией в гене Е1А, согласуются с данной гипотезой, но не доказывают ее. Делецнон- ные мутанты по El А, такие, как di 312, могут размножаться в трансформированных клетках линии 293, происходящих из почек эмбриона человека. Геномы этих клеток содержат стабильную вставку левого конца генома аденовирусов и экспрессируют транскрипты Е1А и Е1В. При низкой множественности заражения клеток HeLa мутантом di 312 экспрессии ранних генов Е1А-Е4 не наблюдается. При высокой множественности заражения экспрессируются области EIB-E4,а экспрессия гена Е1А остается на низком уровне, но при этом происходит нормальная продукция вируса. Возможно, что при высокой множественности заражения El А продуцирует достаточное количество функционального белка, который инактивирует постулируемый клеточный репрессор.

Показано, что возможны и другие способы активации области Е1В-Е4 без участия функционально активного гена Е1А, например при изучении клеток HeLa, зараженных одновременно мутантом di 312 и /s-мутантом по непосредственно раннему гену вируса псевдобешенства (герпесвируса) [75]. Вирус псевдобешенства выбран потому, что он на ранней стадии выключает синтез клеточных белков, а /s-мутант вируса псевдобешенства G1 не ингибирует этот синтез. ДНК-связывающий белок (DBP) представляет собой продукт раннего гена аденовирусов, который исполь- зовали в качестве индикатора синтеза аденовирусных белков. Он экспрессируется при пермиссивной температуре в коинфициро- ванных клетках. Комплементационная функция вируса псевдобешенства была температурочувствительной, что и следовало ожидать, исходя из характера мутации Gl. Поскольку не должно быть гомологии между /sGl-белком вируса псевдобешенства и аденовирусным белком Е1А, логично предположить, что общие ¦функции связаны с хозяйским белком. Это предположение подтверждает активация клеточных генов под действием продукта гена El А. Синтез хозяйского белка 70К индуцируется диким типом аденовируса, но его не обнаруживают в клетках HeLa, зараженных мутантом di 312. Белок 70К постоянно синтезируется в клетках 293, в которых экспрессия гена Е1А также постоянна. Индукция синтеза 70К наблюдается в клетках после теплового шока (43°С) [210]. На основании полученных данных предположили, что: а) клеточный регуляторный элемент подавляется продуктом гена Е1АAd2 или тепловым шоком в незараженных клетках или б) Е1А непосредственно активирует 70К-белок. Эти привлекательные представления, особенно если учесть, что участок Е1А/Е1В играет важную роль в трансформации клеток, открывают новые экспериментальные подходы для изучения специфических функций хозяина, изменяющихся в процессе трансформации вирусами.

Среди ранних вирусных генов выявлены и другие регуляторные функции. DBP-продукт гена Е2А, вероятно, подавляет инициацию транскрипции области Е4 через 6 ч после заражения аденовирусом. В отличие от того что имело место при заражении диким типом, при заражении клеток HeLa при непермиссивной температуре Н5 tsl25-мутантом по DBP выключения транскрипции Е4 не наблюдалось [8, 212]. При этом, как обычно, происходило сначала усиление, а затем ослабление синтеза мРНК Е2А. По-видимому, в этих опытах эффектором служит ts DBP, а не изменение уровня синтеза его мРНК. DBP регулирует также стабильность, но не синтез Е1А и EIB-мРНК. При заражении Н5 tsl25эти мРНК в 3—5 раз стабильнее при непермиссивной температуре, чем при пермиссивной [32].

Синтез ДНК завершает раннюю фазу цикла репликации вируса. Механизм переключения с ранней на позднюю транскрипцию до сих пор неясен. При смешанном последовательном заражении клеток двумя различными серотипами аденовируса, продукты транскрипции которых можно различить, было показано, что механизм переключения представляет собой цис-функ- цию вирусной ДНК [298]. В отличие от первого введенного генома второй не давал продукции поздних мРНК. Таким образом, в процессе репликации ДНК в геноме происходят некоторые изменения, позволяющие начать позднюю транскрипцию. Однако никаких изменений в метилировании, ковалентном связывании концевого белка, распределении нуклеосом или перераспределении генома во внутриядерном пространстве не обнаружено. Насколько важно в этом процессе присутствие ДНК в одноцепочечной форме, пока неясно.

Ранние белки

В последние годы значительный успех в понимании функций ранних белков аденовирусов был достигнут благодаря применению систем синтеза их ДНК in vitro и изучению трансформации клеток ее фрагментами. В настоящее время определены некоторые функции трех ранних аденовирусных полипептидов, которые принимают участие в репликации ДНК и кодируются областями Е2А и Е2В [298]. Полипептиды, связанные с аденовирусной трансформацией, идентифицированы; они кодируются генами LIAи Е1В. Однако еще мало что известно о более чем десяти других полипептидах, кодируемых генами Е1А, Е1В, ЕЗ и Е4. Для определения ранних аденовирусных полипептидов исполь-зуют электрофорез в полиакриламидном геле, гибридселектив- ную трансляцию, иммунологические и другие методы.

Уже давно известно, что сыворотки хомячков, несущих опухоли, индуцированные аденовирусами, реагируют с клетками культур тканей, зараженными аденовирусами [135, 238, 255, 261, 309], причем эти клетки проявляют иммунореактивность еще до начала репликации вирусной ДНК [93]. Ранние антигены получили название Т-антигенов из-за их предполагаемой связи с опухолями, индуцированными аденовирусами. Показано, что сыворотки хомячков, несущих опухоли, осаждают большую группу Т-антигенов, что отличает аденовирусы от SV40, у которого имеются только большой и малый Т-антигены. Домен аденовирусной ДНК, ответственный за трансформацию, локализован в левой части (0—12%) вирусного генома, однако в некоторых трансформированных клетках стабильно интегрирована значительно большая часть генома [101]. Сыворотки животных, несущих опухоїи, индуцированные такими клетками, осаждали ДНК-связывающий белок (DBP) [93]. DBP, продуцируемый некоторыми линиями трансформированных клеток, картируется на участке 62—66%, т. е. весьма далеко от трансформирующего участка [169]. Поскольку имеется много других ранних аденовирусных белков, следует пересмотреть обозначение аденовирусных Т-антигенов; Т-антигенами должны называться только продукты участков Е1А и Е1В.

Некоторые ранние полипептиды идентифицированы с помощью 355-метионина, последующей иммунопреципитации сыворотками хомячков с опухолями, индуцированными аденовирусами, и определения их электрофоретической подвижности в

ДСН-полиакриламидном геле [112, 321]. Однако при этом трудно различить вирусные и хозяйские белки, поскольку синтез последних не подавлен в ранней фазе инфекции. Эту трудность удалось преодолеть с помощью системы трансляции in vitro, которая позволила различить вирусные и хозяйские транскрипты* а также картировать гены полипептидов в аденовирусном геноме. Отбор аденовирусных мРНК с помощью рестрикционных фрагментов ДНК оказался чувствительным методом картирования, с помощью которого удалось идентифицировать более 15 ранних вирусных полипептидов [112, 174]. Сравнительно нетруд-но картировать полипептид в геноме, гораздо сложнее установить, какой из полипептидов, кодируемых одним участком генома, наиболее важен для генетических функций, картируемых в этом участке (рис. 28.5). Например, выявлено много полипептидов с мол. массами 38—55К, гены которых картируются в Е1А, и три полипептида, считываемые с участка Е1В. Новые методы, такие, как сайт-специфический мутагенез клонированных ДНК, позволили вводить мутации в критические участки гена, чтобы определить роль каждого из полипептидов, кодируемых одним и тем же участком ,[204]. С помощью мутагенеза, направленного на экзон 13S-MPHK, который одновременно является нитроном 12S-mPHK, стало возможным различить функции 12S- и 13S-mPHK, гены которых перекрываются на участке Е1А. Термины «интрон» и «экзон» трудно использовать для многих участков аденовирусной ДНК, поскольку одни и те же участки генома могут быть и нитронами, и экзонами для различных мРНК, считываемых с одной и той же области ДНК. Другая сложность терминологии — это обозначение полипептидов по их молекулярным массам, которые могут несколько различаться по данным разных лабораторий [198]. Эта проблема обусловлена вариациями условий электрофореза, а также использованием разных маркерных белков.

Изучение функций полипептидов, кодируемых ЕЗ, осложняется тем, что область ЕЗ несущественна для размножения аденовирусов в культуре ткани. Делеции в этом районе не влияюг на репликацию вируса. Геном аденовируса может рекомбинировать с фрагментами ДНК SV40 и давать стабильные недефектные гибриды Ad—SV40, в которых вставка ДНК SV40 расположена в области ?5 [170]. Однако глнкопротеин 19К, кодируемый ЕЗ, связывается с основным комплексом гистосовместимости грызунов (Н2) или человека (HLA), и это позволяет проводить функциональный анализ в системах, где можно измерять опосредованную Т-клетками цитотоксичность, зависящую от поверхностных антигенов вируса [160]. Об участке Е4 информация скудна. Известно лишь, что делеции, устраняющие полипептид. ПК, кодируемый участком Е4, не влияют на урожай вируса [262]. Несомненно, что область Е1 является критической для аде-новирусной трансформации [101, 308]. Хотя /s-мутации в областях Е2А и Е2В влияют на эффективность трансформации, вызываемой Е1 [97, 183, 333], для сохранения трансформированного фенотипа необходим только участок Е1. Для полной трансформации нужны оба домена El (ElА и Е1В). До конца неясно, необходим ли El А только для включения синтеза полипептида Е1В или его влияние более прямое. Клетки, трансформированные точько последовательностью El А, не обладают некоторыми свойствами полностью трансформированных клеток. Они становятся перевивающимися клеточными линиями, но не растут в полужидком агаре и синтезируют не все Т-антигены (например, не синтезируют антигены, кодируемые Е1В). Эти частично трансформированные клетки растут медленнее клеток, трансформированных вирусом или вирусной ДНК, содержащей и Е1А, и Е1В. Область El А, локализованная между 1,3 и 4,5 ед. карты, кодирует in vivo шесть полипептидов от 38 до 51 К, которые считываются с двух мРНК. Два из них — кислые полипептиды 51К и 48К — синтезируются на более длинной и более короткой мРНК соответственно [249]. Полипептид 51К двух мутантов по кругу хозяев H5hrlи H5hr2синтезируется в укороченной форме, 28К, тогда как их полипептид 48К синтезируется нормально. Это происходит из-за мутации в интроне 48К-мРНК, приводящей к сдвигу рамки считывания в 51К-мРНК. Аналогичные результаты были получены при замене Т на G в третьем положении триплета в интроне 12S-MPHK, которая не приводила к изменениям в белке, кодируемом 13S-MPHK [204]. Эти точечные мутанты при заражении клеток с высокой множественностью (800 БОЕ/кл) дают нормальный урожай вируса (такой, как у вируса дикого типа). Как обсуждалось ранее, по-видимому, какие-то клеточные факторы позволяют компенсировать дефект гена Е1А [209].

Вирионы Ad 12 и Ad5 могут трансформировать клетки культуры ткани, но их онкогенный потенциал для животных сильно различается. Недавно удалось выявить функциональные различия между областями Е1А высокоонкогенного Adl2 и неонко- генного Ad5 [20, 263]. При трансфекции изолированным І:/A-фрагментом Ad 12 или Ad5 в присутствии активного гена Е1В показано, что синтез основного полипептида гистосовместимости I класса (Н2 или HLA) выключает только El A Ad 12. При этом Н2-мРНК не синтезируется, т. е. подавление образования Н2 осуществляется на уровне транскрипции.

Участок Е1В, располагающийся между 4,6 и 11,2 ед. карты, кодирует три полипептида— 19К, 20К и 53К. Белки 20К и 53К имеют общие пептиды триптического гидролизата, но белок 19К уникален по этому признаку и транслируется в другой рамке считывания [198]. Полипептид 19К обнаруживали среди бел-ков шести линий клеток, трансформированных Ad2, в то время как 20К- и 53К-полипептиды не обнаруживали в некоторых из этих линий. Важная роль 19К-полипептида была доказана в экспериментах по комплементации с мутантами Ad5 по участку Е1В: dl313и dl434[155а]. Плазмида, которая содержала после-довательность левой части Е1В, кодирующую 5'-конец мРНК и связанную с геном тимидинкиназы HSV, компенсировала дефект этих мутантов в отсутствие большего полипептида Е1В.

Большой полипептид Е1В (58К по номенклатуре Сарноу и соавторов) связывается с клеточным белком 54К, количество которого увеличивается во многих клетках, трансформированных разными опухолеродными ДНК-содержащими вирусами [261]. Так, в клетках, трансформированных SV40, клеточный белок 54К связывается с большим Т-антигеном SV40, что указывает на возможное участие 54К-белка в трансформации. Моноклональные антитела против Т-антигена Ad5ElB-58K иммунопреципити- ровали клеточный 54К-белок в комплексе с 58К, но не реагировали со свободным 54К. Функциональное значение клеточного белка 54К пока не известно.

Область Е2

Е2 кодирует белок DBP, связывающийся с одноцепочечной ДНК, а также с концами двухцепочечной ДНК [181]. DBP синтезируется в больших количествах в клетках, зараженных аденовирусами. По данным электрофореза в полиакриламидном геле мол. масса DBP составляет 72К, однако по данным секвенирова- ния открытой рамки считывания участка 2АAd2 и Ad5 его мол. масса составляет 58К [157, 158]. Препараты этого белка в ранних работах содержали протеолитический фрагмент 44К, который образуется в результате ограниченного гидролиза полипептида 72К химотрипсином [5, 150, 310]. Дальнейшее протеолити- ческое расщепление приводит к образованию фрагмента 34К* который так же, как и фрагмент 44К, представляет собой С-ко- нец полного DBP [84]. In vivo DBP интенсивно фосфорилирован, но очищенный фрагмент 34К практически не содержит фосфатных остатков [84, 150]. По-видимому, все фосфатные остатки сгруппированы на N-конце. Известны /s-мутанты (Н5 tsl25и Н5 tsl07)с одинаковой заменой одной аминокислоты в С-кон- цевом участке [159]. Мутанты H5tsl25и H5tsl07выделены независимо, но содержат совершенно идентичный дефект в полипептиде. Были изолированы /5+-псевдоревертанты Н5 tsi07,причем у ряда их независимых изолятов замены также сгруппированы на очень маленьком участке [159, 213]. DBP необходим для репликации ДНК in vivo и in vitro [84, 97, 126, 144, 155, 168, 312]. N-конец DBP не обязателен для репликации ДНК, но в некоторых ситуациях он необходим, так как принимает участие в регуляции транскрипции [5, 84, 155].

Область Е2В кодирует два полипептида, которые принимают участие в репликации ДНК [1,85, 177,274]. Предшественник концевого белка (рТР) синтезируется в виде полипептида 80К, который в процессе сборки вириона превращается в белок 55К, ковалентно связанный с ДНК [38]. Расщепление осуществляется 23К-протеазой, кодируемой на участке 60 ед. карты вирусного генома [29, 322]. С помощью комплементационного анализа в системе синтеза ДНК in vitro недавно обнаружена аденовирусная ДНК-полимераза, кодируемая участком Е2В[85, 177]. Очищенная ДНК-полимераза вируса дикого типа комплементиро- вала дефект H5tsl49(мутанта, который не способен к репликации ДНК при повышенной температуре). Было показано, что дефект H5tsl49картируется между 18 и 22 ед. карты. Хотя открытая рамка считывания аденовирусной ДНК-полимеразы предсказывает белок с мол. массой -^120К (22,9—14,2 ед. карты) [1], по данным электрофореза в полиакриламидном геле его мол. масса составляет 140К [176]. Функциональная роль полипептидов Е2А и Е2В подробнее обсуждается в раздече «Репликация ДНК аденовирусов».

Области ЕЗ и Е4

Область ЕЗ при размножении вируса в культуре ткани не имеет критического значения, однако функции его продуктов существенны для репликации вируса в организме хозяина (человека) [160, 224]. Среди продуктов, кодируемых ЕЗ, выявлены полипептиды 19К, 14,5К и 14К [165]. Белок 19К — это гликопротеин, который появляется в мембранах зараженных клеток. Согласно ряду данных, gpl9K взаимодействует с основными антигенами гистосовместимости клеток грызунов и человека [228а]. Участок Е4 кодирует ряд полипептидов, включая белок 11К, связывающийся с ядерным матриксом [262]. Этот полипептид иммунологически одинаков во всех группах аденовирусов — от А до Е и является единственным примером столь консервативного белка среди всех известных ранних белков аденовирусов. Мутанты со сдвигом рамки считывания не образуют иммунологически распознаваемый белок 11К, однако они нормально размножаются в клетках HeLa и фибробластах W138 человека.

Репликация ДНК аденовирусов

Репликацию ДНК аденовирусов активно изучали in vivo и in vitro. Успешному изучению способствовал ряд особенностей самой ДНК и ее репликации. Во-первых, при репликации аденовирусной ДНК в клеточном ядре синтез хозяйской ДНК подавляется более чем на 90% [123, 236], вследствие чего большая часть радиоактивных предшественников включается в вирусную ДНК. Во-вторых, размер ДНК большинства серотипов составляет примерно 36 kb, а мол. масса 23-106, поэтому с ней легко манипулировать, не вызывая значительных повреждений [106]. В-третьих, удалось создать несколько систем для репликации аденовирусной ДНК in vitro [4, 143, 147], включая такую, в которой могут происходить инициация и элонгация синтеза на экзогенных вирусных матрицах [37]. С помощью этих систем удалось очистить и охарактеризовать три продукта вирусных генов и несколько клеточных полипептидов, необходимых для синтеза аденовирусной ДНК. В-четвертых, был получен хороший /s-мутант (H5tsl25), ДНК-фенотип которого проявлялся в опытах in vitro и мутантный генный продукт которого использовали для контроля точности репликации ДНК in vitro [126, 144, 168, 310, 313]. Среди всех эукариотических хромосомных и вирусных ДНК аденовирусная ДНК >никальна в том смысле, что ее репликация может инициироваться in vitro.

Структура аденовирусной ДНК и промежуточных продуктов репликации

Аденовирусная ДНК представляет собой линейную двухцепо-чечную молекулу с инвертированной концевой избыточностью примерно в 100 Ьр для большинства исследованных серотипов [7, 27а, 90, 337]. ДНК, выделенная из вирионов, содержит на каждом б'-конце по одной молекуле ковалентно связанного концевого 55К-белка (концевого белка, ТР) [246, 250]. Концевые инвертированные избыточные последовательности позволяют каждой цепи ДНК образовывать кольцевые структуры, напоминающие «сковороду с ручкой», причем двухцепочечная «ручка» точно повторяет концы исходных двухцепочечных молекул [90, 337] (рис. 28.7). Данные о промежуточных продуктах репликации были получены в исследованиях на культуре клеток. Репликация полуконсервативна [128, 228, 311]. Реплицирующиеся молекулы седиментируют быстрее, чем родительские дуплексы [14, 30, 311]. Однако при денатурации реплицирующихся молекул образуются цепи различной длины вплоть до полноразмерных [123, 307]. Эти данные исключают возможность ковалентного связывания нуклеотидов с родительской молекулой. В более ранних исследованиях не было показано накопление метки во фрагментах Оказаки, что дало основания предложить механизм непрерывной элонгации обеих растущих цепей [123]. Несмотря на непрекращающиеся споры относительно существования фрагментов Оказаки [318, 335], сегодня ясно, что наращивание до I I

Рис. 28.7. Модель репликации ДНК аденовирусов. Начало репликации аденовирусной ДНК с любого из концов двухцепочечной молекулы, вытеснение одной из родительских цепей и последующая репликация вытесненной цепи описаны в тексте. Репликация типа I относится к синтезу на двухцепочечной матрице, а типа II — к синтезу на одноцепочечной матрице. (С разрешения из [163] © 1977 MIT.)

черней цепи аденовирусной ДНК происходит непрерывно в на-правлении 5'->-3' [227]. Обнаруженные «фрагменты Оказаки», вероятно, были артефактом, вызванным частичным торможением синтеза в неблагоприятных условиях опыта [335].

На основании данных о том, что промежуточные продукты репликации аденовирусной ДНК содержат длинные одноцепочечные ДНК, можно предположить следующий механизм роста цепи: одна из родительских цепей реплицируется, а вторая замещается продвигающейся репликативной вилкой [287, 288] (рис. 28.7). В ранних экспериментах наблюдали не поддававшееся интерпретации преимущество правого конца генома для начала репликации. В дальнейшем, однако, было показано, что участки, ответственные за начало и терминацию репликации, присутствуют на обоих концах молекулы [125, 163, 286, 328]. Анализ полностью реплицированных молекул после короткой инкубации с 3Н-тимидином показал, что наибольшее количество метки содержится в рестрикционных фрагментах на обоих концах ДНК. Наиболее простая интерпретация этих данных состоит в том, что должна существовать внутренняя точка начала репликации, от которой происходит рост цепи в обоих направлениях. Для реализации такой схемы необходимы фрагменты Оказаки, по крайней мере для синтеза «отстающей» цепи. Это объяснение, однако, противоречит опытам с ДНК гибрида Ad-SV40— —Ad2 + NDi [124]. В гибридной молекуле вставка SV40 располагается возле правого конца. Кинетика включения метки в по-следовательности SV40, которые можно было выделить гибриди-зацией ДНК—ДНК, указывала на то, что оба конца молекулы могут служить точками начала и окончания репликации ДНК. Это предположение подтвердили биохимические электронно-микроскопические исследования [125, 163, 286, 328]. Анализируя кинетику накопления радиоактивной метки на разделенных цепях, удалось выявить градиент радиоактивности от 3'- к 5'-кон- цу. Поскольку цепи ДНК антипараллельны, на одной цепи включение радиоактивности уменьшалось справа налево, а на другой— слева направо. В результате этих исследований стало ясно, что начало репликации ДНК аденовирусов происходит непосредственно на концах ДНК либо очень близко от них. Окончательные доказательства того, что репликация аденовирусной ДНК начинается на концах молекулы, получены при использовании систем репликации in vitro [175].

Лечнер и Келли [163] представили электронные микрофотографии реплицирующихся молекул ДНК и предложили моде 1Ь репликации, объясняющую полученные ранее биохимические данные. Они отнесли к типу I молекулы, у которых репликация начинается на одной цепи и продвигается по дуплексу, а репликацией типа II назвали рост дочерней цепи на матрице одноцепочечной ДНК (рис. 28.7). В случае реинициации до завершения предыдущего цикла репликации образуются более сложные молекулы [163]. Хотя репликация типа I может начинаться на любом конце молекулы, отмечено, что первый цикл репликации способствует реинициации на том же конце молекулы (рис. 28.8). Это наблюдение было подтверждено в системе репликации in vitro, где завершался синтез молекул, инициированных in vivo в клетках HeLa [131]. Выбор конца молекулы для первого цикла репликации, по-видимому, случаен, а причины предпочтительной реинициации на том же конце молекулы пока не выяснены.

Во время активной репликации аденовирусной ДНК в клетках подавление белкового синтеза циклогексимидом практически не влияет на инициацию и элонгацию новых вирусных цепей [128]. Эти данные позволяют предположить, что инициация синтеза новых молекул аденовирусной ДНК уникальны, а компоненты механизма ее репликации стабильны. Благодаря этому при изучении аденовирусов можно успешно применять систему репликации in vitro ,[37, 143, 147], тогда как синтез всех других

Рис. 28.8. Электронные микрофотографии реплицирующейся ДНК Ad2. А. ДНК, реплицирующаяся по типу I с двумя одноцепочечными молекулами, вытесняемыми при репликации. Обе вилки движутся с одного конца, что определено по длине одноцепочечных ветвей. Б. ДНК Ad2, содержащая частично дуплицированную цепь, реплицирующуюся по типу II. В. Молекула, реплицирующаяся по комбинированному механизму типа I и II, содержит пять сайтов репликации. Сайт репликации справа расположен в точке соединения двухцепочечной и одноцепочечной структур (репликация типа II). Остальные четыре сайта реплицируются по типу I с вытесняемыми одноцепочечными ветвями. На всех пяти сайтах репликация началась с одного конца и все растущие цепи движутся в одном и том же направлении (указано стрелками). Незначительная миграция ветвей (смещение цепи) происходит у основания каждой из репликационных вилок, что обнаружено по появлению «усов». (С разрешения из [131].)

вирусных и клеточных ДНК нуждается в постоянном синтезе белков.

Возникает вопрос, каким образом происходит инициация репликации на линейной молекуле, не образующей конкатеме- ров [123] и циркулярно не пермутированной [63]. В случае РНК-затравки существует проблема достройки 5'-конца после удаления затравки. Если допустить, что затравкой для синтеза дочерней цепи служит «шпилька», как у парвовирусов, то для ее образования необходимо присутствие комплементарных последовательностей на З'-конце. Однако такие последовательности на концах аденовирусной ДНК не обнаружены [278]. Для Новый

dC + t:

белок

?Ju С

Белок

iiii

Белок

(?“i= (7“f

5' Новая цепь

?dtc^

LIL-, j, .

-dC(i>

• t • і і

—J- 1 і 1 *

-^JdC -f-

Рис. 28.9. Модель инициации синтеза ДНК аденовирусов с участием белковой затравки. Модель, впервые описанная Рекошем и соавторами [246], обсуждается в тексте.

решения проблемы инициации Рекош и соавторы [246] предложили модель белковой затравки. Согласно этой модели, ковалентное присоединение первого dXTP происходит к концевому белку (рис. 28.9). Тот факт, что растущие цепи ДНК ковалентно связаны с белком, подтверждает эту модель. Однако при анализе зараженных клеток не удалось выяснить, когда присоеди-няется концевой белок — в начале или в процессе роста цепи [279, 280]. Окончательные доказательства справедливости модели белковой затравки получены при использовании систем синтеза ДНК in vitro [175].

Известны три основных типа систем для изучения репликации аденовирусной ДНК in vitro. Сначала успех был достигнут в системе целых ядер, выделенных из клеток, зараженных аденовирусами [289, 311]. Такие ядра проницаемы для меченых дезоксирибонуклеотидфосфатов. В изолированных ядрах элонгация цепей аденовирусной ДНК происходит по полуконсерватив- ному механизму, однако, поскольку в интактных ядрах сохранялись все клеточные ДНК, полученная информация мало чем отличалась от того, что уже было известно из опытов с зараженными клетками.

Дальнейшим этапом было выделение ядер из клеток, зараженных аденовирусами, с последующей частичной солюбилизацией аппарата репликации. На основании данных о том, что в присутствии саркозила и ионов магния аденовирусную ДНК можно выделить в связи с ядерными мембранами, была создана система репликации аденовирусной ДНК in vitro. В этой системе использовали изолированные ядерные мембраны [228, 272, 339], и в ней были получены полноразмерные одноцепочечные молекулы вирусной ДНК. Матрицей служила эндогенная ДНК, инициация синтеза на которой уже произошла in vivo в составе ядерного мембранного комплекса (зона М в градиенте сахарозы). В системе присутствовали ДНК-полимеразы а и у, 3'-*- -V 5'-экзонуклеаза, кодируемый вирусом ДНК-связывающий белок, вирусный белок 11К, РНК-полимеразы II и III [247], а также хозяйская ДНК. С помощью подобных систем, так же как и в первом случае системы изолированных ядер, не удалось получить новой информации для понимания механизма репликации ДНК аденовирусов [317]. Остался нерешенным вопрос о том, является ли связывание репликативного комплекса с ядерными мембранами артефактом выделения или действительно отражает функциональную ассоциацию in vivo. Когда зараженные ядра после короткой инкубации с 3Н-тимидином рассматривали в электронном микроскопе, радиоактивные зерна были случайным образом распределены по всему ядру [194, 273]. Эти данные были интерпретированы как опровергающие ассоциацию вирусной ДНК с ядерными мембранами при репликации. Итак, значение ассоциации промежуточных продуктов репликации аденовирусной ДНК с ядерными мембранами остается неясным, так же как и факт обнаружения реплицирующихся молекул в зоне М [317].

Следующим шагом в развитии систем репликации in vitro стали полностью растворимые свободные от клеточной ДНК экстракты, в которых могла реплицироваться ДНК аденовирусов [26, 143, 340]. В экстрактах ядер зараженных клеток, полученных с помощью сульфата аммония, происходила элонгация на эндогенных ДНК-матрицах, инициированных in vivo. Полноразмерные продукты, синтезированные in vitro, проходили те же промежуточные стадии, что и in vivo, и были ковалентно связаны с белком [131]. По данным электронной микроскопии в процессе синтеза in vitro происходила элонгация молекул и I, и II типов [26, 131]. В растворимой системе репликации получены интересные данные о DBP [126]. Так, было показано, что DBP необхо дим для элонгации цепей ДНК. Экстракты из клеток, зараженных мутантом по DBP H5tsl25,были не активны при повышенных температурах, но их активность восстанавливалась при добавлении очищенного DBP вируса дикого типа. Эти экспери-менты объяснили, почему были неудачны попытки выяснить причины, по которым не происходит in vivo репликация ДНК таких /s-мутантов: дефектны ли они на стадии инициации или на стадии элонгации. Было показано, что перед добавлением дезо- ксинуклеотидов необходима преинкубация репликативного ком-плекса H5tsl25для инактивации /s-DBP, поскольку, если репликация началась, DBP стабилизируется в репликативном комплексе. Таким образом, в условиях in vivo запаздывание выключения репликации на период, равный времени синтеза, может быть не результатом мутации по инициации, а результатом стабилизации продукта /s-гена в функциональном комплексе [312]. Эта система репликации была использована для доказательства того, что 44К-С-концевой домен DBP дикого типа может комплементировать функцию H5tsl25при непермиссивных температурах [5]. Однако еще предстоит доказать, что 44К-фраг- мент DBP действует самостоятельно при непермиссивных температурах, а не вследствие внутригенной комплементации с N-концом дефектного DBP H5tsl25[84].

Разработанные недавно системы изучения репликации, в которых инициация и элонгация цепей полностью зависят от экзогенной матрицы [37], позволили наконец провести очистку и функциональный анализ каждого из компонентов системы реп-ликации [84, 108, 144, 177]. Система нуждается в ДНК, ковалентно связанной с концевым белком 55К (ДНК-белок, или ДНК-Б), и 0,1 М солевом экстракте ядер из зараженных клеток, репликация в которых остановлена на ранней стадии гидроксимоче- виной [37]. Обнаружено, что экстракты из ядер клеток, зараженных H5tsl25,температурочувствительны по элонгации на матрице ДНК-Б, и их активность зависит от добавления DBP дикого типа при непермиссивной температуре [144]. Показано, что по ряду критериев промежуточные продукты, образующиеся in vitro, действительно возникают в ходе реакции репликации. После очистки активных компонентов этой системы стало ясно, что ядра зараженных клеток можно заменить смесью экстракта из цитоплазмы зараженных клеток (Ad-цит) и экстракта из неза- раженных ядер (ЯЭ) [127, 137]. Эти данные послужили основой для характеристики трех вирус-специфических полипептидов из цитоплазмы и двух факторов из незараженных клеток.

Дочерняя ДНК, образующаяся при репликации in vitro, так же как и родительская, содержит белок, ковалентно связанный с ее 5'-концом [277]. Однако она присоединена к полипептиду 80К, который является предшественником (рТР) концевого белка 55К (ТР) [38, 39]. Существует мутант H2tsl,дефектный по протеазе, расщепляющей ряд вирусных полипептидов, включая 80К-рТР [21]. С ДНК вирионов H2tsl,синтезированной при не- пермиссивной температуре, ковалентно связан не 55К-ТР, а его предшественник 80К-рТР. Комплекс аденовирусной ДНК с белком, выделенный из мутантных вирионов, полностью активен in vitro; в клетках, зараженных H2tsl,при непермиссивных температурах синтезируется нормальное количество аденовирусной ДНК [39]. Отсюда следует, что превращение рТР в ТР, которое обычно происходит в процессе сборки вирионов, не влияет на синтез ДНК.

Очистка факторов репликации ДНК из грубого экстракта поставила ряд задач, которые были решены при разработке специфических методов анализа отдельных стадий процесса репликации. Например, возникла необходимость отличить включение радиоактивных предшественников в ходе репликации от неспецифических репаративных синтезов, что особенно важно на ранних стадиях очистки. В грубых экстрактах из ядер незараженных клеток в присутствии комплекса ДНК-Б наблюдается активный репаративный синтез, но репликация в них отсутствует. Был разработан метод, позволяющий быстро определять специфическую репликативную активность во фракциях с колонки [127]. ДНК-Б гидролизовали ферментами рестрикции и полученные фрагменты добавляли в реакцию репликации. Специфический синтез должен происходить только на концевых фрагментах. Продукты репликации обрабатывали протеазой и в агарозном геле анализировали продукты специфического синтеза на концевых фрагментах. Этот метод, в котором измеряют одновременно и инициацию, и элонгацию, позволил установить, что концевые фрагменты участвуют по крайней мере в двух циклах репликации in vitro [127].

С помощью последовательной очистки факторов, участвующих в элонгации, было убедительно доказано, что для репликации необходимы три продукта вирусных генов. Один из них, DBP, необходим для элонгации как в системах, зависящих от экзогенной матрицы, так и в системах, в которых используются аммонийсульфатные экстракты ядер [144]. Это показано с помощью мутантов по DBP (H5tsl25и H5tsl07)и при удалении DBP из реакционной смеси для репликации [40, 67, 84, 137]. При добавлении очищенного H5tsl07-DBP в систему репликации, полностью зависящую от экзогенного DBP, репликативная активность при непермиссивной температуре не восстанавливалась, но при пермиссивной восстанавливалась. Вместе с тем DBP дикого типа был активен при обеих температурах. Функциональные домены DBP картировали с помощью частичного гидролиза трипсином и химотрипсином очищенного белка, высокомеченного in vivo 32Р-ортофосфатом. C-Концевой химотриптический полипептид 34К полностью комплементировал функцию элонгации аденовирусной ДНК [84]. Он не содержал 32Р в отличие от интенсивно меченного N-конца, что доказывает, что фосфорилирование DBP не имеет функционального значения для синтеза ДНК. Связывание 34К-фрагментом H5tsl07и H5tsl25одноцепочечной ДНК температурочувствительно при температурах выше 33 °С в условиях, используемых для реакции репликации in vitro (20 мМ NaCl). В то же время связывание интактного DBP H5fsl07не блокируется даже при 45 °С; это указывает на то, что несущественный для функции DBP N-конец может влиять на конфигурацию и вследствие этого на связывание С-конца [156]. Следовательно, связывание DBP необходимо, но не достаточно для комплементации синтеза ДНК, зависящего от экзогенного DBP. Еще одно подтверждение этому получено в опытах с гетерологичным DBP из Е. coli, который связывался с аденовирусной ДНК, но функционально не замещал DBP аденовируса [5, 137]. Хотя мутанты H5tsl07и H5tsl25получены независимо, они несут одинаковую замену в положении 413 (пролин на серии) [159]. Это позволяет предположить существование предпочтительных сайтов для отбора жизнеспособных /s-мутантов по DBP.

Выделены и охарактеризованы два других вирусных продукта— 80К-рТР и 140К-ДНК-полимераза (ДНК-пол) [176]. Первоначально эти белки выделяли в виде комплекса, но их удалось разделить центрифугированием в градиенте глицерола, содержащем 1,8М мочевину. Аденовирусная ДНК-полимераза отличается от клеточных полимераз а, Р и у не только ассоциацией с рТР, но и тем, что она не способна выполнять функциональную роть клеточных полимераз. Недавно с помощью ДНК~-мутанта H5tsl49,дефект которого картируется в гене N(18—22 ед. карты), было проведено подробное изучение аденовирусной ДНК-по- лимеразы [85, 177, 305, 332]. Было показано, что добавление ДНК-полимеразы дикого типа, свободной от рТР, комплементи- рует H5tsl49[85, 177]. Эти наблюдения позволяют предположить с высокой степенью вероятности, что ДНК-полимераза кодируется вирусом и картируется в генном локусе N.Последние результаты по секвенированию указывают на существование открытой рамки считывания между 22,7 и 14,3 ед. карты для

Ad2 [1,94] и для Ad7 [66а], которая может служить кодирующей областью для полипептида 120К — кандидата на роль кодируемой вирусом ДНК-полимеразы.

Исследование в системе in vitro показали, что рТР служит затравкой для репликации ДНК [175]. Сначала к смеси неочищенного экстракта ядер незараженных клеток, цитоплазматического экстракта зараженных клеток и ДНК-Б добавляли S2P-dCTP в отсутствие трех других dXTP. Это приводило к образованию меченого комплекса 80К—dCMP, который обнаруживали методом электрофореза белков в ДСН-полиакриламидном геле. При дальнейшей очистке экстрактов было показано, что для образования комплекса 80K-dCMP необходимы рТР, ДНК-полимераза и ДНК-BAd, но не DBP [137]. Эксперименты с экстрактами из клеток, зараженных /s-мутантами по DBP, под-твердили эти биохимические данные [40, 84]. Кодируемый вирусом DBP не обязателен для инициации новой цепи в присутствии экстракта из ядер незараженных клеток. Поскольку первый dGMP является двадцать шестым нуклеотидом от каждого конца, представлялось возможным удлинить 80К—dCMP до двад-цатишестичленного нуклеотидного фрагмента добавлением dATP, dTTP и в качестве терминатора цепи ddGTP [175]. В ДСН-поли-акриламидном геле подвижность рТР, соединенного с фрагментом из 26 нуклеотидов, соответствовала молекуле 88К, что удобно использовать в качестве теста для ранней элонгации. Ранняя элонгация частично стимулируется аденовирусным DBP [85, 86]. рТР—продукт вирусного генома, поскольку он транслируется in vitro с мРНК, отобранной с помощью фрагмента аденовирусной ДНК, расположенного от 11,2 до 31,5 карты. Вероятнее всего, рТР кодирует открытая рамка от 28,9 до 23,5 ед. карты [66а, 94, 274].

Из ядер незараженных клеток HeLa были выделены факторы, необходимые для инициации и элонгации на ДНК-Б [108, 177, 208]. В частности, к ним относится ядерный фактор I — полипептид 47К. Для полноценного функционирования он нуждается в DBP. Так как вирусный DBP не обязателен для инициации репликации вирусной ДНК, вероятно, активность фактора I в неочищенных ядерных экстрактах клеток HeLa усиливается клеточным DBP, который удаляется в процессе очистки фактора I. В этих условиях вирусный DBP, по-видимому, способен замещать DBP клеток HeLa, однако DBP Е. coliне активен в этой системе. Недавно было показано, что фактор I узнает последовательность возле точки начала репликации аденовирусной ДНК, соединенной с белком, и селективно связывается с этой последовательностью, защищая нуклеотиды 17—48 от действия ДНК-азы I [207]. Связывание фактора I—первый пример специфического взаимодействия хозяйского фактора с аденовирусной

ДНК. Другой ядерный белок — фактор II — необходим для полной элонгации аденовирусного комплекса ДНК-Б. Он состоит из двух полипептидов— 15К и 17К. Поскольку не удается измерить активность фактора II при анализе элонгации концевых фрагментов (фрагментов, составляющих 4 и 12% генома), скорее всего он требуется для сравнительно поздней стадии элонгации. Ни фактор I, ни фактор II не обладают ДНК-полимеразной активностью. Однако фактор II обладает активностью топоизоме- разы типа I, и очищенная эукариотическая топоизомераза I может замещать фактор II. Однако по размеру фактор II значительно меньше, чем топоизомераза клеток HeLa, и, вероятно, представляет собой либо активный протеолитический фрагмент, либо эукариотическую топоизомеразу I нового типа [108].

Известно, что афидиколин — ингибитор клеточной ДНК-поли- меразы а — подавляет синтез аденовирусной ДНК in vitro и in vivo [161, 185, 237]. Синтез аденовирусной ДНК in vivo значительно менее чувствителен к афидиколину, чем синтез ДНК клеток HeLa. Однако in vitro синтез аденовирусной ДНК подавляется примерно такими же его концентрациями, как и ДНК-полимераза а. На основании данных по ингибированию афидико- лином и неудачных попыток обнаружить вирус-специфическую ДНК-полимеразу полагали, что ферментом, необходимым для синтеза аденовирусной ДНК, может быть клеточная ДНК-полимераза а. Однако в настоящее время показано, что ДНК-полимераза а не участвует в синтезе ДНК аденовирусов. Очищенная аденовирусная ДНК-полимераза устойчива к действию высоких концентраций афидиколина. На стадию инициации — образование рТР—dCMP афидиколин не действует, но на элонгацию ДНК-Б, даже в очищенных системах в присутствии вирусного DBP, рТР, ДНК-полимеразы и факторов I и II, он действует и при низкой концентрации (100 мМ). По-видимому, мишенью для афидиколина является не ДНК-полимераза, а какой-то другой компонент системы. Согласно недавним сообщениям, ею может быть вирусный DBP. Это заключение основано на изменении скорости подавления синтеза ДНК в присутствии афици- колина в зависимости от повышения температуры до непермис- сивной в культуре клеток, зараженных мутантом по DBP H5tsl25[79].

Недавно были пересмотрены представления о роли ТР на 5'-концах родительских молекул. Известно, что протеолиз Ad-ДНК-Б значительно ингибирует репликацию ДНК in vitro [37, 144]. Однако, протеаза удаляет не все аминокислтоы с 5'-кон- цевого dCMP. Напротив, при гидролизе пиперидином удаляются все аминокислоты, и 5'-концевой нуклеотид оказывается не связанным с серином ТР [293]. После ренатурации денатурированной пиперидином ДНК матрица восстанавливает свою функцію- нальную активность, и в обычных условиях на ней идет репликация. Эти наблюдения на депротеинизированной ДНК позволяют предположить, что информацию, необходимую для реакции инициации, содержат сами последовательности ДНК [108, 293, 306]. Сконструирована плазмида, pLAl, содержащая последовательность левого конца ДНК Ad5 [284]. Рестриктаза EcoRlлинеаризует плазмиду pLAl слева от точки начала репликации аденовирусной ДНК и активирует плазмиду для репликации

Рис. 28.10. Схема репликации аденовирусной ДНК. Предложенная модель ре-пликации ДНК представляет собой модифицированную модель «катящегося- кольца», в которой синтез происходит одновременно с вытеснением одной цепи. Вслед за инициацией и элонгацией в структуре I в результате вытеснения, образуется структура II. При последующей элонгации образуется промежуточный продукт репликации(III). Структура IV накапливается в отсутствие активности топоизомеразы I. Афидиколин, не влияющий на аденовирусную ДНК-полимеразу в системе экзогенной ДНК тимуса теленка, ингибирует активную репликацию аденовирусной ДНК и приводит к образованию цепей, сходных по размеру с образующимися в отсутствие топоизомеразы. При добавлении топоизомеразы I элонгация цепей продолжается. По-видимому, топо- изомераза удаляет запутанные комплексы ДНК, которые мешают движению «вилки». Однако неясно, почему элонгация цепи останавливается на 25% длины генома. Вытеснение интактной одноцепочечной молекулы из структуры VI может приводить к образованию структуры «сковорода с ручкой», обозначенной на рисунке VII. Такие структуры в процессе репликации не наблюдали. Комплементарные участки (102 основания на каждом конце), благодаря которым образуется структура VII, должны образовать концевую структуру, идентичную концам структуры I. Концевая структура содержит двухцепочечную последовательность для связывания ядерного фактора I, который способствует специфической инициации. (С разрешения из [86].)

Ю Заказ № 1131 этой ДНК in vitro. Неактивными матрицами были кольцевые pLAl, плазмида, линеаризованная по другим сайтам, и плазмида, не содержащая аденовирусных последовательностей [108, 207, 281]. В качестве матриц использовали также ДНК делеционных мутантов с частично удаленными вирус-специфическими вставками. Мутант, у которого была удалена последовательность аденовирусной ДНК с 35 по 455 основание, был так же активен, как и исходная pLAl, а мутант с делецией от 17-го по 45-е основание был неактивен [282].

Аденовирусы серотипов 2, 7 и 12 (группы С, В и А) содержат консервативные последовательности с девятого по восемнадцатое основание на каждом конце. Замена оснований внутри этих последовательностей приводит к уменьшению функциональной активности матрицы [294]. На этом основании можно предположить существование общего участка, узнаваемого при инициации [7, 60, 270, 282]. Чтобы выявить участок, узнаваемый при инициации репликации ДНК, изучали репликацию очищенных матриц ДНК-Б различных серотипов в системе из ядерных экстрактов клеток, зараженных Ad2 [282]. Аденовирусы ДНК Б серотипов 4, 7, 9 и 31 проявляли некоторую матричную активность в экстрактах из клеток, зараженных Ad2, но обычно активность этих систем была меньше, чем гомологичной системы ДНК-Б Ad2 и экстракта ядер клеток HeLa, зараженных Ad2. Несмотря на то что Ad2 и Ad7 обладают меньшей гомологией на участке с 1-го по 9-е основание, чем Ad2 и Ad31, ДНК-Б Ad7 значительно более активен, чем ДНК-Б Ad31. Значение репликации депро- теинизированной ДНК in vitro требует дальнейшего изучения, но уже сейчас создается впечатление, что рТР в растущей цепи имеет более важное значение для репликации аденовирусной ДНК, чем родительский концевой белок. Возможно, что узнавание и инициация облегчаются благодаря специфичности или конфигурации цепи между 9-м и 48-м основаниями на каждом из концов молекулы и родительскому концевому белку. Общая модель инициации и элонгации аденовирусной ДНК представлена на рис. 28.10.

Поздняя транскрипция

Начало синтеза вирусной ДНК совпадает с началом поздней фазы инфекции; при этом картина резко меняется по сравнению с ранней и промежуточной транскрипцией [48, 186, 266, 297, 298]. Хотя механизм переключения с ранней фазы на позднюю малопонятен, ниже мы представим современные экспери-ментальные данные по этому вопросу. Во многих случаях механизм синтеза и процессинга транскриптов в аденовирусной и эукариотической системах сходны. Новейшие данные в этой области, такие, как открытие сплайсинга, впервые получены (и правильно интерпретированы) на клетках, зараженных аденовирусами [16, 48]. О процессинге известно довольно много, включая транспорт мРНК из ядра в цитоплазму. Разработаны системы, в которых аденовирусная ДНК транскрибируется in vitro с физиологических промоторов [193, 326]. Однако в синтезе аденовирусных мРНК in vivo и in vitro существуют значительные различия, которые пока не имеют объяснения.

Механизм переключения ранней транскрипции на позднюю

Механизм действия факторов, ответственных за переключение транскрипции с ранней фазы на позднюю, изучен еще недостаточно. Недавно получены экспериментальные данные, ука-зывающие на то, что некоторые из этих факторов действуют по цис-механизму [298]. Клетки последовательно заражали двумя родственными аденовирусами группы С, продукты трансляции и полипептиды которых можно различить. В эксперименте ставилась задача определить, могут ли экспрессироваться поздние гены с нереплицирующейся ДНК (Ad2+NDldp2) суперинфицирующего вируса при заражении клеток, в которых уже происходит поздняя вирусная транскрипция на первично введенном вирусе (Ad5tsl25). Было показано, что в условиях эксперимента поздняя транскрипция ДНК Ad2+NDldp2 отсутствовала. Какова природа цис-действующих факторов регуляции транскрипции, неизвестно; не исключено, что таким фактором является какое- то свойство самой вирусной ДНК. Показано, что регуляция не связана с метилированием ДНК [315]. В одном из объяснений предполагали существенную роль в регуляции замены концевого белка 55К введенного вируса на 80К-предшественник в растущей цепи, в другом — протяженного одноцепочечного участка ДНК, что кажется маловероятным, так как транскрипция происходит на ds-матрице [25, 33]. К тому же поздняя транскрипция продолжается в клетках даже после того, как ингибиторами (или сдвигом температуры в случае /s-мутантов) прерывается уже начавшийся синтез ДНК [298]. Предполагали также нуклеосомные различия [295] и пространственное разделение ДНК-матриц, но ни одна из гипотез не была проверена.

Анализ полисом через 18 ч после заражения Ad2 показал, что практически все мРНК были вирус-специфическими [15, 186]. Уровень накопления вирусных транскриптов в 10 раз превышал уровень, характерный для ранней фазы. Хотя транскрипция хозяйских последовательностей в ядре продолжалась, в цитоплазму переносилась лишь незначительная часть транскриптов [15]. 10*

Точный механизм блокировки процессинга хозяйских последовательностей не установлен, но, по-видимому, блокировка происходит после полиаденилирования. Протяженность вирусной транскрибируемой последовательности соответствует примерно 50% потенциальной информации в обеих цепях (рис. 28.11). Транскрипты, гомологичные г-цепи, соответствуют примерно 80% кодирующей емкости этой цепи, в то время как транскрипты, гомологичные /-цепи, представляют около 20% емкости этой цепи [107, 266]. Регуляция синтеза непосредственно ранних, пред- ранних (Е1А), задержанно ранних (Е1В, Е2А, Е2В, ЕЗ, Е4) и промежуточных (IVa2, IX) транскриптов в поздней фазе очень сложна. Количество L1 как транскрипта поздней области значительно увеличивается, но он синтезируется и как один из непосредственно ранних транскриптов. В ранней фазе L1 может транслироваться с образованием полипептидов 52К и 55К [267]. Однако ІІІа-мРНК, входящая в ту же группу поздних транскриптов и имеющая тот же сайт полиаденилирования, что и участок, кодирующий 52—ббК-'Полипептиды, не синтезируется в ранней фазе инфекции [267]. Эти данные позволяют предположить, что регуляция осуществляется на уровне сплайсинга РНК. Почему в ранней фазе блокирована транскрипция с других поздних районов, таких, как L4 и L5, неизвестно. Остается также невыясненным вопрос о времени транскрипции участков L2 и L3. Некоторые исследователи обнаруживали L2- и ЬЗ-транскрипты р ранней фазе, но никому не удалось обнаружить продукты трансляции с транскриптов L2—L5. Е2А мРНК и кодируемый сю полипептид DBP синтезируются как в ранней, так и в поздней фазе инфекции, однако во время поздней фазы точка инициации транскрипции основной лидерной последовательности меняется с 75 ед. карты на 72 ед. карты; минорный лидер при этом расположен около 87 ед. карты [27] (рис. 28.11). Транскрипция другой ранней области, Е4, ингибируется на поздней стадии аденовирусным DBP [22, 212]. Результаты, полученные в системе транскрипции in vitro (см. ниже), позволяют предполагать, что DBP непосредственно подавляет транскрипцию с промотора Е4 [ПО]. Промежуточные транскрипты для полипептидов IVa2 и IX продолжают синтезироваться в поздней фазе. Оба этих полипептида нужны для сборки вириона [266].

Открытке сплайсинга молекул мРНК

Аденовирусы послужили моделью при изучении ряда общебиологических процессов у эукариот. Одним из наиболее значительных открытий было отсутствие коллинеарности между мРНК и кодирующими их генами. Полученные результаты привели к предположению о том, что мРНК являются продуктом Сердцевина

52к- Пентон ' ' Гексон

13.6К 55К На ш рИУрИ П Z3К

1 Z і з

14 К

Белки

13 К 21К 26К 16 К

32К 55К

FHK

14,5 К

Невирионные ПК

101< Белок ФибриЛД

юок рил 1бк н

х У і—*•

: *-15 L4 L3 L2

11

I П VA 1=5

3.

5’|-

г-цепь I - цепь

і. . і.

80

100

90

70

60

50

40

30

20

ю

Аденовирусы и их репликация 149

¦-3

Е28

72 К DBP

87 К рТР

Еа2

140 К

Полиме

раза

Белки

Рис. 28,11. Транскрипционная и трансляционная карта Ad2. Ранние мРНК обозначены буквой Е и показаны тонкими линиями. Поздние мРНК обозначены буквой L и показаны толстыми линиями. Все они начинаются от 16 ед. карты и содержат трехдольный лидер. Некоторые из поздних мРНК содержат также четвертый лидерный фрагмент і, кодирующий белок 14К. Ранние транскрипты, продолжающие синтезироваться и на поздней стадии, обозначены толстыми линиями. Основной поздний трехдольный лидер обозначен 1, 2 и 3. Структурные компоненты вириона обозначены римскими цифрами, неструктурные — цифрами, соответствующими их молекулярным массам. (С разрешения из [27]. Многие данные, касающиеся ранних транскриптов, взяты из рис. 28.5.)

11К 13К 17 К 10К 14 К

(19К,2;К,24К,5гоК)

Е2А

РНК

Е4

-1

335.

Гекссм

i Ci I 1 I fcoRI

Рис. 28.12. Обнаружение сплайсинга на 5'-конце гексоновой мРНК Ad2. А. мРНК гексона гибридизуется не только со своей кодирующей последовательностью, но и с тремя короткими фрагментами в трехдольном лидере. Участки ДНК, не образующие дуплексов с РНК, образуют одноцепочечные петли, обозначенные на схеме как 1, 2 и 3. Б. Электронная микрофотография гибрида между одноцепочечной ДНК фрагмента 1 Eco RI и гексоновой мРНК и схема расположения последовательности, кодирующей гексон по отношению к местам расщепления рестрикционной эндонуклеазой ?coRI. (С разрешения из [16].)

соединения транскриптов отдельных участков генома, и внесли огромный вклад в понимание биогенеза эукариотических мРНК [16, 44а, 48]. После гибридизации мРНК гексона с кодирующим его фрагментом (50—60 ед. карты) было обнаружено, что 5'-кон- цевой участок мРНК остается неспаренным. Это побудило к поискам другой последовательности ДНК, которая гибридизо- валась бы с этим 5'-концом [16]. Как следовало из опытов с од- иоцепочечной ДНК, формирование 5'-концов посредством миграции ветви по двухцепочечной ДНК было исключено. При гибридизации мРНК гексона с г-цепью ?coRI-фрагмента (0—55 ед. карты) наблюдали структуру, представленную на рис. 28.12. Три петли одноцепочечной ДНК в положениях 16,8; 19,8 и 26,9 ед. карты были правильно интерпретированы как неспаренные участки ДНК, чередующиеся с короткими районами гомологии между DcoRI-фрагментом ДНК и гексоновой мРНК. К аналогичному заключению привели независимые эксперименты, в которых после образования R-петель между суммарной мРНК и полноразмерной аденовирусной ДНК проводили вторую гибридизацию с денатурированными рестрикционными фрагментами левого конца генома [48]. На электронных микрофотографиях удалось установить положение гексоновой мРНК и лидерных последовательностей в одной молекуле. Подобные эксперименты были повторены с мРНК других поздних структурных и неструктурных полипептидов. Оказалось, что и здесь лидерные последовательности картировались в районе 16,6; 19,6 и 26,6 ед. карты, а положение основной кодирующей последовательности соответствовало положению на генетической карте, которое определяли ранее для каждого полипептида другими методами.

Биохимическое подтверждение сплайсинга получено из многих источников. На 5'-іконцах смеси поздних мРНК Ad2 так же, как и на 5'-концах очищенных мРНК белка фибриллы и поли-пептида 100К, обнаружена уникальная 11-членная последова-тельность [92, 151]. Соответствующие кодирующие последова-тельности (86,3—91,3 ед. карты для белка фибриллы; 66,1—

ед. карты для полипептида 100К) не предохраняли 11-членную последовательность на б'-конце мРНК от гидролиза РНКа- зой А. Однако последовательность от 14,7 до 21 ед. карты защищала 5'-концевую последовательность и мРНК белка фибриллы, и мРНК полипептида 100К [151]. В других экспериментах фрагмент ДНК от 17 до 29,1 ед. карты гибридизовался со многими поздними мРНК, которые были активны в системе трансляции in vitro [307]. В дополнение к сайтам сплайсинга, описанным для «трехдольного» лидера поздних мРНК, определены многие другие сайты сплайсинга, представленные на рис. 28.11. Это сайты для каждой из пяти групп поздних генов (LI—L5), дополнительная лидерная последовательность для мРНК белка фибриллы и точки сплайсинга на /-цепи. Ранние мРНК, считываемые и с г- и с /-цепей, также подвергаются сплайсингу. Не сплайси- рована только мРНК белка IX. Последовательности, узнаваемые при сплайсинге аденовирусных мРНК, в основном те же, что и при сплайсинге эукариотических транскриптов (GU на 5'-конце и AG на З'-конце удаляемого фрагмента) [251, 314а]. Помимо сплайсинга существуют и другие механизмы соединения нуклеотидных последовательностей. В других системах, таких, как биосинтез цепей иммуноглобулинов [64], обнаружены различные внутри- и межмолекулярные рекомбинации ДНК- Однако ясно, что у аденовирусов сплайсинг мРНК происходит на уровне транскриптов. Механизм и энзимология сплайсинга малопонятны, но предполагают, что в этом процессе принимают участие особые вирус-ассоциированные (VA) РНК (см. ниже) [197].

Синтез поздних мРНК

Участок, кодирующий декануклеотид, содержащий 10 из 11 оснований на 5'-концах поздних мРНК, локализован в районе

ед. карты [92]. Этот декануклеотид, к которому 5'-GTP (кэп)

присоединяется посттранскрипционно, расположен непосредственно перед первым участком сплайсинга трехдольного лидера. Он синтезируется РНК-полимеразой II — ферментом, синтезирующим все аденовирусные мРНК. РНК-полимераза II и синтез аденовирусных мРНК одинаково чувствительны к низким дозам а-аманитина [240, 320]. Последовательность около промотора может содержать структуру «стебель и петля» (stem-and- loop) [342]. Промотор располагается через 31 основание от последовательности ТАТАААА, однако делеции в этом участке не запрещают транскрипцию in vivo [11]. Основания 5—13 на б'-конце мРНК комплементарны последовательности около З'-конца 18S-pPHK [342]. Функциональное значение этого факта еще неясно.

Синтез поздних транскриптов начинается от 16,45 ед. карты и продолжается вправо до примерно 99 ед. карты [70, 82, 342]. Это заключение основано на экспериментах трех типов. В экспериментах первого типа, в которых проводили гибридизацию рестрикционных фрагментов правого конца генома с ядерными импульсно-мечеными транскриптами, обнаружили, что гомологичные молекулы РНК довольно длинные [10, 324]. Но они были гораздо короче в случае рестрикционных фрагментов, расположенных ближе к 16,45 ед. карты. Время введения метки было меньше, чем время синтеза полных транскриптов длиной 26 kb. Сходный вывод позволяют сделать данные по УФ-картированию [98]. Статистически более вероятна инактивация ультрафиолетом синтеза протяженных участков нуклеиновой кислоты, чем коротких. Чувствительность к УФ первичного транскрипта гена белка фибриллы, расположенного в правой части генома (86,3—91,3 ед. карты), оказалась значительно выше, чем можно было бы ожидать, исходя из длины участка, кодирующего полипептид. Данные электронной микроскопии подтвердили основные выводы этих двух биохимических методов [202].

Обычно у эукариот не происходит инициации трансляции на внутренней последовательности мРНК- Конфигурация пяти групп мРНК с фиксированным З'-концом и альтернативными ко-дирующими 5'-последовательностями гарантирует, что все гены первоначальных транскриптов будут транслироваться (рис. 28.11).

Полиаденилирование (присоединение 150—200 оснований к З'-концу) пяти групп поздних транскриптов существенно для транспорта зрелых ядерных транскриптов в цитоплазму или для стабилизации транскриптов в цитоплазме. Добавление аналогов аденозина — тойакамицина и кордицепина, подавляющих синтез poly (А)-последовательности, приводит к накоп. ению в ядре длин-ных РНК-траискриптов [200, 314]. Однако Зиви и соавторы об-наружили, что мРНК, не содержащие poly (А), тоже способны выходить в цитоплазму, но оказываются короткоживущими [341]. Полиаденилирование около гексануклеотида AAUAAA, общего д пя З'-концов многих аденовирусных мРНК, можно экспериментально разобщить от эндорибонуклеазного расщепления, происходящего на концах транскриптов пяти групп поздних мРНК [82, 204а]. Внутренний сплайсинг фрагментов лидера происходит после отщепления З'-конца транскрипта [211]. Механизм, согласно которому происходит выбор одного из пяти возможных участков для расщепления, неизвестен. Оказалось, что некоторые первичные транскрипты нарезаются еще до завершения синтеза полноразмерной РНК. В этих случаях элонгация транскриптов продолжается за сайтом эндорибонуклеазного отщепления. Такое нарезание происходит менее чем у половины синтезируемых молекул, в противном случае нельзя было бы определить положение промоторных участков З'-концевых транскриптов [Ю, 20а, 324]. Однако есть данные о том, что GMP не включается в кэп до тех пор, пока не присоединится poly (А).

8ирус-ассоциированные РНК

Существуют две небольшие РНК с выраженной вторичной структурой, напоминающей структуру тРНК. Они синтезируются с г-цепи аденовирусной матрицы, начиная с 29 ед. карты [34, 35, 196, 218]. В отличие от мРНК они синтезируются РНК-полиме- разой III и не кодируют полипептиды [62, 240а, 329]. Вирус-ас- социированная (VA) РНК I длиной в 155 нуклеотидов была первой аденовирусной РНК, для которой определили первичную структуру [218]. Второй сходный продукт — VA-РНК II кодируется справа от VA-РНК I и не обнаруживается в клетках, зараженных Ad 12. Оказалось, что каждая из этих двух РНК имеет собственный сайт инициации, но обе содержат кэп 5'-pppGp [199]. Промоторы для РНК-полимеразы III располагаются внутри транскрибируемого участка между ( + 58) и (+68) ед. карты [80, 108а]. Регуляция синтеза двух VA-РНК осуществляется координированно. Если синтез VA-РНК I уменьшается из-за делеции, то синтез VA-РНК II при этом увеличивается. Функции VA-PHK в зараженных клетках до сих пор до конца не ясны. Получены данные, свидетельствующие о том, что VA-РНК могут присоединяться в местах сплайсинга к поздним мРНК и способствовать сплайсингу первичных транскриптов [197]. Показана ассоциация VA-РНК с белками нуклеопротеиновых комплексов (Sn РНП, которые узнаются La-антителами, обнаруженными в сыворотках больных системной волчанкой [165]). При добавлении La-анти- тел к ядрам клеток, зараженных Ad2, ингибируется сплайсинг Е1А-мРНК [341]. В незараженных клетках в нуклеопротеиновом комплексе, несущем антигенные детерминанты La, обнаружена U1-PHK [165]. Однако U1-PHK имеет существенную гомологию с последовательностями типичных сайтов сплайсинга, в то время как VA-РНК I отличается от последних [165а]. Согласно недавно полученным данным, VA-РНК контролирует скорость трансляции поздних аденовирусных белков [296]. Делецнонный му-тант по VA-РНК I (di 330), в котором VA-РНК II остается ин- тактной, продуцирует меньшие количества поздних белков. VA-РНК I не влияет на какую-либо из стадий биогенеза мРНК* поскольку трансляция мРНК di 330in vitro проходит нормально. Таким образом, предполагаемая функция VA-РНК I как регулятора сплайсинга не объясняет блокировки трансляции.

Транскрипция аденовирусной ДНК in vitro

Разработано несколько систем транскрипции in vitro, в которых в качестве матрицы используется аденовирусная ДНК. Одна из них включает очищенную РНК-полимеразу II и цитоплазматический экстракт [326]. Другая система, в которой используют экстракт цельных клеток HeLa, не нуждается в экзогенной РНК-полимеразе [193]. Обе системы узнают вирусные и клеточные промоторы. Многие продукты транскрипции идентичны мРНК, синтезируемым in vivo, включая формирование кэпа и метилирование 5'-концов. Среди преимуществ растворимой системы транскрипции следует отметить возможность очистки эндогенных факторов, регулирующих различные этапы биогенеза мРНК, и использования очищенных факторов для восстановления активной системы. Был изучен каскад взаимосвязанных событий, следующих за аденовирусным заражением [76]. В экстрактах из незараженных клеток HeLa in vitro эффективно узнаются шесть промоторов: Е1А (1,4 ед. карты), Е1В (4,7 ед. карты), белка IX (9,8 ед. карты), основной поздний (16,4 ед. карты), ЕЗ (76,6 ед. карты) и Е4 (99,1 ед. карты). ТАТА-последо- вательности этих промоторов расположены в положениях от (—25) до (—31). Три транскрипта — IVa2 (15,9 ед. карты), Е2А (ранний, 75 ед. карты) и Е2А (поздний, 72 ед. карты) —не имеют ТАТА-последовательностей и слабо транскрибируются in vitro. Транскрипт Е2А (поздний, 72 ед. карты) имеет вместо ТАТА последовательность ТАСААА, но это полностью не объясняет низкий уровень транскрипции, поскольку в других случаях, когда она расположена вблизи промоторов других эукариотических мРНК, она активна. Деления ТАТА-последовательностей не уменьшает уровень транскрипции in vivo, однако точки инициации у мутантов с такой делецией часто сильно различаются. Напротив, ТАТААА-последовательность важна in vitro, и деле- ция с (—51) по ( + 5) нуклеотид по отношению к кэп-структуре сильно влияет на транскрипцию. Несмотря на эти различия в регуляции, промоторы, активные in vitro, удивительно сходны с действующими in vivo. Корреляция с характером транскрипции in vivo выявляется в опытах с увечичением количества ДНК или испочьзованием поздних экстрактов. Подобные условия характерны для поздней стадии инфекции; при этом усиливается транскрипция in vivo с основного позднего промотора и гена полипептида IX. Следует помнить, что in vivo основной поздний промотор активен и в ранней фазе инфекции и транскрибируется примерно с той же скоростью, как и аутентичные ранние участки. Таким образом, использование экстрактов из незараженных клеток HeLa для поддержания поздней транскрипции аденовирусов не явтяется нелогичным, как это кажется на первый взгляд. Однако действительно в поздних экстрактах присутствуют уникальные факторы, которые способствуют увеличению скорости синтеза поздних транскриптов и, вероятно, распространению транскрипции за точку, соответствующую 39 ед. карты. При использовании в качестве матрицы для транскрипции in vitro сердцевины аденовирусов характер транскрипции изменялся, что, по-видимому, обусловлено изменениями в структуре ДНК, вызываемыми белками сердцевины [55].

Растворимый экстракт для транскрипции in vitro с помощью РНК-полимеразы II в настоящее время используется и для изучения сплайсинга транскриптов. Оказалось, что этот важный этап биогенеза функционально активных мРНК воспроизводится in vitro [99, 225, 227а, 327]. Изучались также сходные системы, в которых транскрибируется 5.5S-PHK с помощью РНК-полимеразы III in vitro. Этот подход обещает дать важную информацию о транскриптах, синтезируемых этой полимеразой [338].

Поздние полипептиды

Изучение поздних вирусных полипептидов, максимальный ¦синтез которых наблюдается через 20 ч после заражения, облегчено тем обстоятельством, что в это время синтез клеточных бечков подавлен [2, 130, 321]. Большинство вирусных белков, синтезирующихся на поздней стадии, представляют собой структурные белки вириона или их предшественники. Однако продолжают синтезироваться и некоторые ранние белки. Например, ранний неструктурный белок DBP синтезируется и в поздней фазе [2, 310]. Другие неструктурные белки, такие, как белки 100К, 50К и 39К, участвующие в различных этапах сборки, синтезируются как поздние белки [58, 220, 230а].

Картирование генов поздних вирусных белков

Первоначально структурные гены картировали с помощью классических методов генетической рекомбинации [333]. Практически все поздние полипептиды кодируются РНК, комплемен-тарной г-цепи; исключение составляют несколько транскриптов выше 30 ед. карты. Положение мРНК на карте генома уточняли биохимическими методами. мРНК выделяли гибридизацией с рестрикционными фрагментами аденовирусной ДНК. После элюции мРНК транслировали in vitro и полученные продукты анализировали в полиакриламидных гелях [172—174]. Модифи-кацией этого метода, позволяющей более точно картировать положение генов, служит остановка трансляции гибридами (ОТГ или HART от англ. hybrid arrested translation) [227, 248]. В методе HART также используют определенные рестрикционные фрагменты ДНК, но в нем не требуется очистка мРНК. Денатурированный фрагмент двухцепочечной ДНК или одну из его цепей отжигают со смесью мРНК, и мРНК до и после гибридизации ДНК — РНК транслируют in vitro. Гомологичные мРНК гибридизуются с ДНК и поэтому не транслируются. Когда рибосома и растущая цепь в процессе элонгации наталкиваются на двухцепочечный гибрид ДНК — РНК, остановка трансляции происходит внутри полипептида. HART — очень точный и простой в исполнении метод, для которого не требуется очистка мРНК, обычно сопровождающаяся потерями материала. Порядок трансляции полипептидов с поздних мРНК, содержащих трехдольный лидер 52К—55К, Illa, III, IVa, pVII, V, pVI и II был определен с помощью метода HART. Этот метод с исполь-зованием гибридизации ДНК — РНК в значительной мере вытеснил картирование с помощью рекомбинации между сероти- пами, основанной на различиях вирусных полипептидов разных серотипов [259].

Поскольку транскрипты имеют общие 3'-концевые участки полиаденилирования, но различные по длине основные кодирующие последовательности, трансляция каждой из мРНК может начинаться с ближайшего к 5'-концу инициирующего кодона ATG. Это важно в связи с тем, что эукариотические мРНК не способны к внутренней инициации трансляции. Три из одиннадцати (II—XII) структурных белков образуются из полипептидов- предшественников (pVI, pVII и pVIII), которые нарезаются на последней стадии созревания вируса [21, 182, 322]. Полипептиды X—XII, по-видимому, являются продуктами процессинга больших полипептидов, таких, как основной полипептид сердцевины [132].

Сборка вирионов

Сборка вирионов в ядре — сложный процесс, начинающийся со сборки одиночных полипептидов в капсомеры в цитоплазме [130]. Капсомер гексона представляет собой тример, состоящий

из трех идентичных полипептидов (II), прочно удерживаемых вместе без участия ковалентной пептидной или дисульфидной связей. Время синтеза мономеров гексона составляет 3,4 мин* причем сборка 80% мономеров происходит быстро: 7i/2^4 мин [130]. Полипептиды пентона синтезируются в течение 1,6 мин. Сборка капсомера из пяти полипептидов основания пентона и трех полипептидов фибриллы имеет двухфазную кинетику. 25% пентонов собирается быстро в течение 20 мин, а остальные — в течение 10—11 ч [130]. Сборка гексона осуществляется с помощью другого вирус-специфического полипептида. Представленные выше результаты были получены при изучении двух /s-мутантов— H5tsl7и H5ts20, у которых не происходит сборки три- меров гексона [179]. В детальных пептидных картах дикого типа и мутантов tsl7и ts20не выявляется каких-либо структурных различий между их полипептидами гексонов. tsl7и ts20несколько отличались фенотипически от дикого типа по действию на сборку цианида и циклогексимида после перехода к пермиссив- ным условиям. На основании этих экспериментов можно предположить, что /s-повреждение находится в другом пептиде (или пептидах) и что дефектный полипептид функционирует в качестве «белка подложки» [179]. «Белок подложки» определяют как белок, необходимый в процессе образования капсомеров, но отсутствующий в конечном продукте. Это определение подтверждается тем, что и мутанты /s/7, и мутанты ts20имеют повреждения в ЮОК-белке, который интенсивно связывается с мономером гексона, но быстро освобождается при тримеризации [36* 87, 220]. Оказалось, что ЮОК-белок связывается с образующимися полипептидами гексона на полисомах [36]. Сборка тримеров гексона из мономеров и участие в ней ЮОК-белка были воспроизведены в системе in vitro [36, 311]. С геном ЮОК-белка частично перекрывается ген небольшого полипептида ЗЗК, но полипептид ЗЗК транслируется в другой рамке и поэтому не имеет общих с белком 100К олигопептидов и не участвует в сборке [219]. Возможна самосборка пустых капсидов из капсомеров гексона, по-видимому, через образование наномеров, каждый из которых соответствует одной из 20 сторон вириона. При разрушении аденовирусов обычно обнаруживаются наномеры, но их не удается выделить в качестве промежуточных продуктов сборки. Детали сборки пентона еще предстоит выяснить.

Из опытов с /s-мутантами по сборке и с обратимой сшивкой лабильных промежуточных продуктов сборки вытекает, что следующим этапом сборки является стадия капсида или «легкого интермедиата» [59]. Капсид с константой седиментации 600S и плавучей плотностью в CsCl 1,315 г/см3 содержит полипептиды pVI, pVIII, 50К, 39К и Illa и, конечно, гексон [58]. Полипептиды pVI и pVIII обычно ассоциированы с наномерами гексона из:

разрушенных вирионов, а полипептид Illa связан с перипентон- ными гексонами [71]. На этой стадии присутствует IIS-фрагмент ДНК, ассоциированный с легким капсидом. Этот фрагмент, по- видимому, является интермедиатом, захваченным в процессе введения генома в заранее сформированный капсид. Он представлен преимущественно левым концом генома, содержащим в пределах первых 400 нуклеотидов последовательность узнавания для упаковки ДНК [109]. Субгеномный размер ДНК объясняется, вероятно, разрывом частично упакованной 348-ДНК в процессе выделения промежуточного продукта. Расшифровка сигнала, который направляет упаковку с левого конца, первоначально казалась странной, поскольку у большинства серотипов аденовирусов 100—150 нуклеотидов идентичны на обоих концах молекулы ДНК. Вопрос решили с помощью серии мутантов Ad 16, которые содержали редупликации последовательностей левого конца (от 200 до более 500 нуклеотидов) на правом конце генома. Анализ этих мутантов показал, что если редуплицировано более 390 нуклеотидов, то инкапсидация начинается с любого конца, тогда как при редупликации менее 290 нуклеотидов сохранялось преимущество инкапсидации с левого конца. Таким образом, создается впечатление, что сигнал узнавания должен быть между 290 и 390 основаниями слева. Эта последовательность перекрывается с некоторыми регуляторами транскрипции Е1А.

Полипептиды 50К и ЗЭК действуют как «подложки» при образовании легкого капсида, поскольку они удаляются на следующем этапе [58]. Полипептид 50К, по-видимому, является полипептидом IVa2 и синтезируется с /-цепи в обеих фазах инфекции [230а]. Следующий промежуточный продукт сборки седименти- рует так же, как 6008-частицы, но имеет по сравнению с ними большую плавучую плотность (1,37 г/см3) в CsCl. Он содержит 348-ДНК, связанную с 80К-предшественником ТР, но не содержит белков сердцевины. Последние добавляются на следующем этапе в виде полипептидов V и pVII. Инкапсидация вирусной ДНК идет и без них. Полагали, что для нейтрализации заряда ДНК перед упаковкой необходимы основные ДНК-связывающие белки. Ранние исследования кинетики заполнения вириона различными полипептидами показали, что после 30-минутной инкубации с радиоактивной меткой она появилась сначала в белках сердцевины, а затем в гексоне [130]. Эти результаты согласуются с представлениями о том, что внутренние полипептиды включаются в заранее собранную пустую оболочку, которая была синтезирована и собрана еще до 30-минутного мечения.

Предполагают, что «голая» ДНК входит в капсид через одну из открытых вершин. Количество полипептидов основания пентона и фибриллы в капсиде на каждом из этапов сборки точно не известно. Некоторые исследователи считают, что большинства из 12 вершин содержат капсомер пентона уже на ранней стадии формирования капсида, однако другие не обнаруживают значительных количеств полипептидов основания пентона и фибриллы до стадии «молодого» вириона [138а]. Белок IX также появляется на стадии «молодого» вириона. «Молодые» вирионы имеют константу седиментации 750S и плавучую плотность 1,345 г/см3. На последней стадии вирусного морфогенеза происходит расщепление всех предшественников, и фрагменты белков pVI, pVIII, pVII и рТР или освобождаются, или деградируют; при этом частицы уплотняются и становятся недоступными для нуклеаз. Протеаза — это полипептид 23К, кодируемый транскрип- том L3. Мутант Ad2tslпри повышенных температурах дефектен по протеазе [21]. Протеаза локализована внутри вириона, и пока частица не разрушена, она не чувствительна к действию таких ингибиторов, как Ь-1-тозиламид-2-фенилэтилхлорметилкетон или фенилметансульфонилфторид. Свободная протеаза локализована в ядре зараженной клетки, где она прикреплена к мембранам. У другого мутанта — H2ts3— блокировано расщепление pVII, тогда как нарезание Va (27К) и Vb (24К) с образованием pVI и pVIII происходит нормально [323]. Молекулярные основы этого избирательного дефекта протеолиза неизвестны.

По данным электронной микроскопии и «зрелые», и «молодые» вирионы расположены в ядре зараженной клетки. Однако, когда препарат готовят с помощью детергента NP40, «зрелые» вирионы полностью уходят из ядра в цитоплазму, а «молодые» вирионы остаются в ядре. Этот артефакт фракционирования клетки полезен при разделении «молодых» и «зрелых» вирионов.

Сборка вирионов блокируется при недостатке аргинина [24] или при повышении температуры инкубации клеток, зараженных вирусом дикого типа [178]. В последнем случае влияние на синтез белков минимально, а сборка капсомеров подавляется значительно. При понижении температуры с 42 до 37 °С сборка возобновляется, и гексон, синтезированный при 42°С, собирается при 37°С. Природа аргининового блока неясна, но для его снятия необходим синтез новых белков. Сообщение о сборке вириона in vitro из радиоактивно меченной ДНК, синтезированной in vivo в отсутствие аргинина, нуждается в подтверждении [336].

Дефектные частицы

В процессе сборки образуется некоторое количество дефектных частиц, особенно много в клетках, зараженных вирусами группы В [Ad 3, 7 и 16], и мало в клетках, зараженных вирусами: группы С (Ad 2 и 5) ,[54]. В данном случае дефектные вирионы не относятся к дефектным интерферирующим (ДИ) частицам, как у некоторых других вирусов [54]. Молекулярный дефект этих частиц состоит в неполной упаковке ДНК. Капсиды могут содержать различное количество ДНК и имеют плотность в CsCl, соответствующую диапазону от плотности пустых капсидов до плотности полноценных вирионов [54, 299]. Неполные вирусные ДНК обогащены последовательностями левого конца генома. Складывается впечатление, что это обусловлено обрывом в разных точках цепи входящей ДНК (в норме для ее входа требуется левый участок из 390 нуклеотидов). Причины аберрантной упаковки аденовирусов группы В еще предстоит выяснить. Извест но лишь, что некоторые молекулы ДНК содержат протяженные участки инвертированных повторов последовательностей левого конца; возможно, аберрантная упаковка объясняется аномальным синтезом вирусной ДНК. Некоторые дефектные частицы способны трансформировать реципиентные клетки, поскольку для трансформации необходим лишь левый конец генома (0— 12 ед. карты).