ГЛАВА 58МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА И МЕДИЦИН

Артур Л. Беадет (Аг(киг Ь. ВеаиДе!)

Геном человека состоит примерно из 3 • 109 пар оснований ДНК и кодирует от 30 000 до' 100 000 белков. Количественно длина ДНК часто оценивается в тысячах оснований (килооснования, ко); например, длина генома человека равна 3 млн ко.

Если бы кто-то захотел отпечатать одну копию одной нити генома человека, то такая копия заняла бы объем, в 170 раз превышающий объем данного издания. Эту аналогию можно продолжить и далее: такая книга должна печататься в 46 отдельных томах, каждый из которых служит эквивалентом одной хромосомы. Индивид наследовал бы один отцовский набор из 23 томов и один материнский также из 23 томов. Серповидно-клеточная анемия была бы эквивалентом изменения одной буквы на определенной странице определенного тома каждого на-бора. Делеция генного кластера а-глобина при а-талассемии была бы представлена утерей одной или двух страниц текста в каждом наборе. Расщепление геномного ДНК ферментами рестрикции (рестриктазами), которые опознают специфические короткие последовательности ДНК и разрезают молекулу в этих сайтах, было бы эквивалентно разрезанию строки текста всякий раз, когда в нем встречается специфическое слово.

Для генома человека характерны два типа полиморфизма.

Второй вид генетических вариаций относится к воздействию на фенотип. Изменение единственного нуклеотида или единственного гена может приводить к драматическому эффекту. В самом деле, изменение определенной последовательности ДНК может оказаться летальным на стадии гаметы, оплодотворенного яйца или нредимплантационного эмбриона.

Анализ генома человека

Мощь методов рекомбинантной ДНК. Размеры, сложность и вариабельность генома человека служат препятствием для анализа индивидуальных особенностей и генов. Выполнимость такого анализа стала реальной в основном благодаря развитию техники рекомбинантной ДНК. Эта техника, позволяющая за один раз анализировать по одному фрагменту ДНК, приписала индекс геному человека и дала возможность находить и изолировать отдельные гены, сегменты генов и последовательности нуклеотидов из обширной библиотеки ДНК. Один из наиболее мощных методов, так называемый метод клонирования ДНК, позволяет изолировать индивидуальные гены или части генов, создавать неограниченное количество копий таких фрагментов ДНК, транскрибировать и транслировать изолированные гены.

Клонирование ДНК состоит и ИЗОЛЯЦИИ фрагментов ДНК, включении их в нуклеиновую кислоту от другого биологического источника (вектор) для манипуляции и размножения. Чаще всего в качестве векторов для этих целей используют илазмиды бактерий, геном которых состоит из небольшой кольцевой двух- нитевой ДНК. Кроме прочих достоинств, эти плазмиды могут кодировать рези- стснтность к многочисленным антибиотикам, а бактерии, содержащие эти плазмиды, могут быть легко изолированы по их резнстентности к антибиотику. Плазмиды содержат сайт начала репликации ДНК и существуют в бактериальной клетке как внехромосомная ДНК. Одна бактерия может содержать много копий млазмидного генома, что обеспечивает как высокий уровень экспрессии клонированного гена, так и простоту выделения плазмидной ДНК.

Другая группа векторов производится из модификаций бактериофага Я, Эти бактериофаги могут усвоить до 15 000 пар оснований вводимой ДНК и удобны для создания библиотек ДНК. Коемидные векторы конструируются из фрагментов бактериофагов и плазмид, такие космиды могут усваивать даже более длинные сегменты вводимой ДНК и объединяют в себе многие технические достоинства как Х-векторов, так и плаэмидных векторов. Молекулы рекомбинантной ДНК выращиваются и манипулируются в организме-хозяине, таком как Е. соИ. Часто для рекомбинации используют штаммы микроорганизмов с поврежденными генами, что понижает вероятность перестройки клонируемой «чужой» ДНК.

Развитие методов клонирования геноэ и других сфер применения техники рекомбинантной ДНК опирается -на специфичность гибридизации нуклеиновых кислот и использование ферментов, расщепляющих ДНК в специфических сайтах (рестрикционные эндонуклеазы).

Гибридизация нуклеиновых кислот.

Нае III образует слепые концы, а два других фермента — однонитевые.

Н|пС т . 5 ' - А к А - Г.- II..- Т - Т - З ' 3' - Т - Т - Ц - Г - А IА - 5'

5'-Ц-Ц|Т-1Ч-А-Г-Г-3' 3'-Г-Г-А-гУ-Т| Ц-Ц-5'

ванную ДНК инкубируют при таких условиях, когда происходит гибридизация нуклеиновых кислот, т. с. взаимное распознавание двух комплементарных нитей и реформация двухнитевой молекулы посредством спаривания оснований. Гибридизация нуклеиновых кислот столь чувствительна, что однонитевую молекулу ДНК можно специфически гибридизировать с комплементарной нитью ДНК или РНК, даже если эта специфическая нить одна на 10 000 неспецифических. Часто при исследованиях методом рекомбинантной ДНК приготавливают одну радиоактивную нить нуклеиновой кислоты, которую затем используют при анализе в качестве зонда. Можно идентифицировать и различать как полностью, так и частично гомологические последовательности. Специфичность гибридизации нуклеиновых кислот, иногда в совокупности с другими методами, позволяет обнаружить единственный ген среди десятков тысяч или вирусную последовательность в массе других последовательностей нуклеиновых кислот.

Рестрик ц ионные'•> н д о н у к л е а з ы. Открытие в микроорганизмах рестрикционных эндонуклеаз, широко известных под названием ферментов ре-стрикции, или рестриктаз, обеспечило возможность манипуляций рекомбинантной ДНК. Эти ферменты опознают специфическую олигонуклеотидную последователь-ность в двухнитевой ДНК и разрезают ДНК в данном сайте.

С а у з е р н - б л о т т и н г (блоттинг по Саузерну). Многие виды анализа генома человека основаны на специальном приложении ДНК-ДНК гибридизации, так называемой блоттинг-процедуре, предложенной Е. М. ЗоиШегп. В клини- ГЕНОМНАЯ

ДНК

РАСЩЕПЛЕНИЕ РЕСТРИКТАЗОИ

ческих приложениях Саузерн-блоттинг (рис. 58-2) начинается с выделения геном-ной ДНК из таких клеток,-как лейкоциты периферической крови или клетки амниотической жидкости. Высокомолекулярную геномную ДНК расщепляют подходящей рестриктазой на серии воспроизводимых фрагментов. Фрагменты ДНК разделяют электрофорезом на агаровом геле. После электрофореза ДНК переносят с геля на мембрану, которая связывает ДНК. Мембрану обрабатывают для денатурации ДНК и пропитывают раствором, содержащим зонд из радиоактивной однонитевой нуклеиновой кислоты. Зонд формирует двухнитевой комплекс нуклеиновой кислоты в тех местах мембраны, где имеется гомологичная ДНК. Затем мембрану промывают для удаления несвязанной радиоактивной нуклеиновой кислоты, а те участки мембраны, которые содержат гомологичную ДНК и, следовательно, зонд, определяются с помощью рентгеночувствительной пленки. Высокая чувствительность Саузерн-блоттинга достигается расщеплением ДНК на малые фрагменты, фракционированием фрагментов и использованием высокочувствительного метода детектирования искомых специфических фрагментов (гибридизированной нуклеиновой кислоты). В целом этим методом можно обнаружить фрагменты геномной ДНК, представляющие собой одиночный ген, или, например, одну миллионную часть генома. Клиническая мощь Саузерн-блот- тинга заключается в возможности анализировать крохотную часть геномной ДНК, взятой у больного.

Аналогичная процедура анализа РНК была названа норсерн-блот- т и н г о м (по контрасту с Саузерн). С помощью этой процедуры можно обна-ружить наличие или отсутствие конкретной РНК. а также ее примерный размер. Термин в е с т е р н - б л о т т и н г описывает производную процедуру, предназ Блот-метод,, Анализируемый материал Фракциони

рование Детектирование Саузерн ДНК Электрофо Гибридизация нуклеиновой кислоты рез Норсерн РНК Электрофо Гибридизация нуклеиновой кислоты рез Вестерн Белок Электрофо Иммунологическое рез “ П римеч. пере в. В названии методов обыгрывается смысловое значение фамилии 8аи1Ьегп • - южный, отсюда МогШегп северный и ^ейегп западный.

наченную для анализа белковых антигенов. При этом белки разделяют электрофорезом и переносят на твердую мембрану. Мембрана инкубируется с антите ламп, а затем связанные антитела детектируются ферментным или радиоактивным анализом. Таким образом, Саузерв-блоттинг, норсерн-блоттинг и вестерн-блот- тинг включают в себя фракционирование и технику детектирования и обеспечм иают чувствительные методы для анализа соответственно ДНК. РНК и белкой (табл. 58-1).

Иллюстрация стратегии клонирования ДНК. Технические аспекты клонирования ДНК будут описаны вкратце, подробно см. "^аТзоп. Многие из ранних успешных попьпок клонирования генов эукариотов состояли в выделении мРНК из гех тканей, в которых содержалось большое количество соответствующего генного продукта, например глобина, иммуноглобулина или альбумина. С помощью обратной транскриптазы создавалась копия первой нити ДНК. комплементарный мРНК (кДНК). Вторая нить ДНК копировалась по первой с помощью ДНК-полимеразы К. соЦ. ДНК-вставка и ДНК-вектор гибрнди зировались и вводились в Е. соИ, где мозаичные молекулы репарировались, сливались и образовали плазмиды рекомбинантной ДНК, содержащие чужеродную ДНК-вставку. В процессе последующего роста и размножения Е. соИ продуцировала нелимитированные количества искомой последовательности ДНК. Такая генеральная стратегия клонирования последовательностей кДНК может оказаться полезной и сейчас. -

' Современные стратегии клонирования генов или последовательностей ДНК используют ту или' иную комбинацию следующих подходов: доступность антител к генному продукту; доступность данных об аминокислотных последовательностях генных продуктов; специфичность нуклеинокислотной гибридизации; знания о биологии дифференцированных систем; анализ биологической функции продукта клонированного гена. ¦

Для частичного выделения специфической мРНК, которую можно использовать для клонирования по описанному выше методу, может быть применена иммунопреципитация полисом с антителами к белку. Другая стратегия опирается на приготовление библиотек кДНК по мРНК, выделенных из специфических источников, ¦ таких как печень, мозг или культура фибробластов человека. Каждая мРНК будет представлена приблизительно в соответствии с ее содержанием в каждой ткани. После клонирования эти библиотеки могут быть подвергнуты скринингу для идентификации последовательностей, экспрессированных в соответствующих тканях. -

Иногда клонированию ДНК могут способствовать функциональные свойства самого клонируемого гена. Продуцируемые ферменты способны компенсировать дефициты, присущие бактериям, или продукты эукариотических гонов, производимые' бактериями, могут иметь легко тестируемые биологические свойства или могут быть идентифицированы специфическими антителами. Если известна аминокислотная последовательность белка, то специфичность генетического кода допускает обратную трансляцию этой последовательности в последовательность нуклеотидов с приемлемой неопределенностью. Затем можно синтезировать одно- нитевые олигонуклеотидные зонды и использовать их для скрининга клонированных библиотек ДНК методом гибридизации с целью идентификации последовательностей, кодирующих данный белок (см. гл. 57). С помощью различных стратегий к настоящему времени удалось клонировать более 300 генов млекопитающих. Изоляция клонированного гена какого-либо вида млекопитающих обычно достаточна для изоляции его эквивалента у человека путем использования нечеловеческого клона в качестве зонда для скрининга человеческой кДНК и библиотек геномной ДНК методом нуклеинокислотной гибридизации.

Создание библиотек рекомбинантной ДНК является существенной частью любой стратегии исследования биологии человека методом рекомбинантной ДНК; для большинства тканей человека библиотеки кДНК уже имеются и доступны. Создание библиотек геномной ДНК необходимо для' получения серий клонов, которые включили бы в себя все последовательности ДНК человека безотносительно их экспрессии.. Такие библиотеки обычно конструируются путем расщепления полного генома человека рестриктазой с последующей вставкой фрагментов в соответствующие векторы рекомбинантной ДНК. Библиотеки .геномной ДНК создаются и для отдельных хромосом человека, которые перед клонированием сепарируются флюоресцент-активационным методом. .

Для более детального анализа генов или ДНК фрагменты клонированной ДНК могут быть расцеплены на последовательности, допускающие определение ' их нуклеотидной структуры. Использование этих методов позволило определить нормальные и мутантные последовательности для многих генов человека.

ПДРФ-карта генома. В 1978 г. Кап и йогу продемонстрировали генетическую вариацию размеров фрагментов, получаемых при расщеплении рестрикционными эндонуклеазами нормальной человеческой ДНК. Эти различия вызываются полиморфизмами последовательностей ДНК, обсужденными выше. Расщепление рестриктазой и Саузерн-блоттинг позволяют идентифицировать эти полиморфизмы и использовать их в качестве маркеров специфических сайтов внутри генома. Если одна из пар оснований той последовательности, которая распознается рестриктазой, варьирует от одной копии .генома к другой илиЛесли ДНК варьирует по длине, то будут варьировать и размеры фрагментов, получаемых при расщеплении ДНК рестриктазой. Если при Саузерн-блоттинге зонд идентифицирует уникальную последовательность ДНК, то паттерн получающихся фрагментов прост. Эти ПДРФ отражают полиморфизмы нормальной ДНК и наследуются в соответствии с законами Менделя. Типичные ПДРФ приведены на рис. 58-3. Высокополиморфный сайт получается тогда, когда некоторая последовательность повторяется тандемом несколько (и при том разное число) раз; это приводит к значительным вариациям длины в данном сайте. Хотя каждая рес- триктаза обнаруживает только одну «порцию» вариации нуклеотидов, сейчас имеется большое число различных рестриктаз, что при значительной генетической гетерогенности позволяет детектировать практически неограниченное число ПДРФ. ¦

Способность анализировать первичную структуру ДНК в клинических образцах и наличие генных маркеров в виде ПДРФ создают возможность для построения подробной карты гена человека. Многочисленные ПДРФ, обнаруживаемые в некоторой малой области, могут оказаться сцепленными так, что они формируют гаплотип, т. е. серию или кластер тесно связанных маркеров ДНК. Такие гаплотипы значительно повышают информативность анализа (см. ниже «Дефекты генов глобина») и являются эквивалентными небольшой части «серийного номера» каждой копии генома. Можно продемонстрировать также связь ПДРФ с генами, ответственными за болезни человека. При хорее Гентингтона, кистозном фиброзе и поликистозе почки взрослых наличие ПДРФ позволило получить клонированные маркеры ДНК вблизи" болезнетворных генов еще до того, как были идентифицированы мутантные гены или изучены их нормальные аллели. «Прогулка по хромосоме» (клонирование непосредственно фланкирующих фрагментов ДНК) на короткие расстояния возможна уже сейчас, и предложены стратегий для «перепрыгиваний» на более удаленные , участки ДНК. Со временем станет возможным клонировать ген, ответственный за любое «менделевское» заболевание. Подробная карта генов человека даст также возможность изучить роль индивидуальных локусов в случаях с полигонной, ¦* 2 +

^7 +

а

РИС. 58-3. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов в ДНК человека.

Сплошные блоки — сегменты ДНК. используемые в качестве зонда, а — родители гомо-зиготны, дети гетерозиготны: б - . родители гетерозиготны, а дети гомозиготны. Символы над стрелками указывают на перерезку ( + ) или отсутствие перерезки (—) рест- риктазами. Цифрами указана длина фрагментов ДНК (в килобазах).

или многофакторной, этиологией. Не следует путать ПДРФ- с мутантными генами. Как правило, болезнетворные мутации слишком редки, чтобы их можно было классифицировать как полиморфизм; лишь в отдельных случаях они могут быть детектированы непосредственно рестриктазами.

Генетическое сцепление и неравномерность сцепления. Общие концепции генетической рекомбинации и сцепления обсуждались в гл. 57. В случае аутосомных генов индивид наследует от каждого родителя по одной копии каждой хромосомы. Каждая хромосома представляет собой уникальную мозаику полиморфных последовательностей ДНК, получающихся в результате кроссинговера хромосом прародителей в процессе мейотической рекомбинации (рис. 58-4). Гены различных хромосом наследуются независимо, однако соседствующие гены одной и той же хромосомы наследуются совместно, если только пара подобных генов не будет разделена мейотическим кроссинго- вером. Поскольку вероятность мейотического кроссинговера ' между удаленными локусами велика, то гены, находящиеся на одной и той же хромосоме, но на большом расстоянии друг от друга, наследуются так же, как если бы они принадлежали разным хромосомам. Генетические расстояния выражаются в сан- тиморганах (сМ) и являются мерой вероятности кроссинговера между двумя локусами. Обычно клинициста интересует вопрос: передал ли данный индивид потомству нормальный или болезнетворный ген? Это справедливо в случае пренатальной или пресимптоматической диагностики и при определении гете- розиготности. Ксли интересующий мутантный ген можно обнаружить прямым анализом ДНК, то нет необходимости рассматривать генетическое сцепление. Однако клиническая диагностика часто опирается на анализ генетических вариаций вблизи болезнетворного локуса. Практически это обычно означает, что нужно использовать ПДРФ в качестве близкого генетического маркера. НОРМАЛЬНЫЙ

АЛЛЕЛЬ

ЦЕНТРОМЕРА ПДРФ#1 ПДРФ#2 ПДрФЛЗ

' ВЫ 2

БОЛЕЗНЕТВОРНЫЙ -I

АЛЛЕЛЬ

а МЕЙОЗ-ТРИ КРОССИНГОВ ЕРА

НОРМАЛЬНЫЙ ЕЛЬ

ПДРФ#1 ПДРФ#2

В N

г^-яг гаГггггг: * - Е =

БОЛЕЗНЕТВОРНЫЙ

АЛЛЕЛЬ

6 . ¦

Рис. 58-4. Демонстрация двух хромосом (одна обозначена сплошными линиями, другая — пунктирными) одного индивидуума до (а) и после (б) мейотического

кроссинговера. ¦

Индивидуум гетерозиготен но болезнетворному локусу с нормальным, аллелем (черный квадрат) и болезнетворным аллелем (белый квадрат) и в трех ПДРФ с аллелями А/В, М/Ы и У/2 (см. текст).

Если имеется клонированный болезнетворный ген, то его можно использовать как зонд; при этом вероятность кроссинговера между этим геном и ближайшим ПДРФ (ПДРФ"Н, см. рис. 58-4) пренебрежимо мала. Если клонированного болезнетворного гена пет, то можно использовать другой клонированный фрагмент ДНК, расположенный вблизи болезнетворного гена. В этом случае могут иметь место редкие кроссинговеры между болезнетворным локусом и ПДРФ (ПДРФ#2, см. рис. 58-4). Другие ПДРФ могут оказаться столь удаленными от болезнетворного локуса, что никакой функциональной связи не проявят (ПДРФ # 3, см. рис. 58-4). При мейозе происходит в среднем 30 35 кроссинговеров у мужчин и, возможно, примерно вдвое больше у жен-щин. Частота мейотических кроссинговеров неодинакова по длине хромосомы.

¦ При использовании сцепления в клиническом анализе существенно, чтобы вблизи болезнетворного гена имелся некоторый информативный генетический маркер. Это означает, что индивид, гетерозиготный по болезнетворному локусу, должен быть также гетерозиготным по ближнему генетическому маркеру. Большинство анализов могут быть информативны, если ПДРФ достаточно часты и если можно идентифицировать полезные полиморфизмы в главных сайтах.

Второе условие успешности генетического анализа состоит в том, что нужно знать фазу между двумя локусами. Например, если ПДРФ дает фрагмент длиной 10 ко и фрагмент длиною 5 ко, то необходимо знать, сцеплен ли болезнетворный ген соответственно с первым, а нормальный • со вторым фрагментом или наоборот. Если известна фаза и анализ определил размер унаследованного индивидом фрагмента, то это сразу же показывает, какой им унаследован ген — нормальный или болезнетворный. Точность предсказания зависит от близости двух генных локусов и от вероятности кроссинговера. Определение фазы обычно основано на изучении предыдущих случаев заболевания в семье или на использовании биологических тестов для определения фенотипа или генотипа. Примеры ПДРФ-анализов в клинических ситуациях приводятся нцже.

Принятие неравновесности сцепления основано на том, что определенные гены в гомогенных популяциях встречаются совместно гораздо чаще, чем это может быть объяснено теорией случайных процессов. Всякая новая мутация происходит в хромосоме с определенным генотипом и вблизи ранее сущест-вующих полиморфных сайтов. В отсутствие кроссинговера через несколько

поколений все дочерние хромосомы, содержащие мутантний ген, будут содержать и те же самые близлежащие последовательности ДНК. При редких кроссинговерах степень ассоциации с ближними соседями будет частично нарушена. Неравновесность сцепления отражает тот факт, что два тесно сцепленных признака имеют тенденцию встречаться совместно чаще, чем в соответствии со средней частотой образования данной пары в генной популяции, вычисленной в предположении о случайном (т. е. равновесном) распределении каждого гена. Паттерны ассоциативности огражают историю кроссинговеров между двумя очень близкими генетическими локусами. Таким образом, конкретный гаплотип ПДРФ может часто наследоваться совместно с болезнетворным геном.

Неравновесность сцепления была продемонстрирована уже в первых ПДРФ, описанных Кап с сотр., вблизи й-глобинного локуса. Фермент Нра I производит фрагменты гена {1-глобина длиной 13; 7,6 или 7 ко, определяемые полиморфизмом в З'-фланкирующей области этого гена. В некоторых западноафриканских и средиземноморских популяциях мутация серповидных клеток связана преимущественно с фрагментом длиной 13 ко. На результаты клинических 'анализов неравновесность сцепления воздействует в оенонним двумя способами. Во-первых, при образовании гаплотипов соседних ПДРФ весьма распространена значительная неравновесность сцепления, так что наблюдается лишь часть всех возможных гаплотипов (т.е. комбинаций ПДРФ). Во-вторых, случайная сильная неравновесность сцепления между ганлотином ПДРФ и болезнетворным аллелем может иметь самостоятельную диагностическую ценность, как это описано ниже в случае дефицита аьантитрипсина.

И II

ИМИ о Ц1МН1М

!1АГ?В и и-Гг*

т Т тт м

*-рО

А/В А/А

У/2 ) У/У

Определение ДНК-маркера, близкого к болезнетворному гену. Разработка подробной карты генома человека с помощью ДНК-маркеров позволяет отыскать генетические сцепления для всех важнейших распространенных заболеваний, наследуемых по законам Менделя. Рис. 58-5 демонстрирует схему анализа на наличие сцепления с использованием двух случайно выбранных ДНК-маркеров, один из которых расположен вблизи болезнетворного гена на одной с ним хромосоме и имеет аллели А и В. а второй расположен на другой хромосоме и имеет аллели X и V. Полученные от семьи сведения позволяют говорить о наличии сцепления между маркером с аллелями А и В и болезнетворным локусом, а анализ достаточно длинной родословной решительно свидетельствует о том, что полиморфный ДНК-маркер расположен вблизи от болезнетворного гена. Для оценки генетического расстояния между двумя маркерами можно использовать частоту кроссинговеров. Любой клон ДНК может быть картирован на хромосому. Такая стратегия использовалась для идентификации анонимного (случайного) ДНК-сегмента, сцепленного с локусом хореи Гентингтона,_ расположенного на коротком плече хромосомы 4 на расстоянии от 3 до 5 сМ. Точно так же область высокополиморфной ДНК вблизи а-глобинного кластера сцеплена с локусом поликистозя почки взрослых на хромосоме 16. Аналогичные усилия могут быть приложены и для диагно-

Р - БОЛЕЗНЕТВОРНЫЙ АЛЛЕЛЬ АНОРМАЛЬНЫЙ АЛЛЕЛЬ

•-БОЛЕЗНЕННЫЙ ФЕНОТИП ЭО- НОРМАЛЬНЫЙ ФЕНОТИП

А/В А/А А/В А/А А/В А/А А/В А/А А/В А/А А/В А/А*- КРОССИНГОВЕР

У/2 У/2 У/У У/У У/2 У/2 У/2 У/У У/2 У/У У/У У/2

Рис. 58-5. Сцепление ДНК-маркера с аутосомно-доминантным заболеванием.

А и В — маркерные аллели в одном сайте, V и 2 — аллели в другом сайте. Приведена

паре хромосом каждого родителя. Гаплотип В и болезнетворный аллель наследуются

совместно от отца, за исключением младшего ребенка, у которого произошел крос- еннговер и болезнетворный аллель унаследовался с гаалотипом А. контроль *

ЦААТ ТАТА

ПЕРВИЧНАЯ РНК

ПРОЦЕССИНГ-РНК

ЗРЕЛАЯ мРНК

стики аутосомно-рецессивных заболеваний; так, с помощью этой стратегии ген кистозного фиброза был картирован на хромосому 7.

Современная картина типичного гена. Типичный ген производит мРНК. которая затем транслируется в белок (рис. 58-6; см. также гл. 57). Тот конец

гена, в котором начинается транскрипция (синтез РНК), называют концом 5'

относительно ориентации мРНК. Сайт, в котором начинается транскрипция, называют стартовым сайтом (Сар-сайтом). Для инициации и управления транскрипцией необходимы по крайней мере еще несколько последовательностей ДНК, расположенных выше «по течению» от этой области (т. е. в направлении, противоположном направлению транскрипции, и на левой части рис. 58-6). Многие верхние области содержат последовательности,' называемые боксами

ТАТА и боксами ЦААТ, которые участвуют в инициации и управлении транс

крипцией. Важные для регуляции гена последовательности могут находиться еще далее вве . IX и вниз от стартового сайта. Те сегменты последовательностей ДНК, которые переводятся в зрелую процессированную мРНК. называются экзонами. Экзоны разделены сегментами, которые называют вставочными последовательностями (ВП), или нитронами. Интроны вначале также копируются на РНК. но при формировании зрелой мРНК —процессинге — они вырезаются, т. е. начальный транскрипт содержит РНК-копии как интронов, так и экзонов, в то время как зрелая мРНК содержит только копии экзонов. Зрелая мРНК содержит также нетранслируемые последовательности РНК, которые располагаются выше кодона инициации синтеза белка (АУГ) и ниже кодона терминации (УАА, УАГ или У ГА). Транскрипция распространяется за пределы сайта, в котором окончится зрелая мРНК. Начальный РНК-транскрипт процессируется посредством расцепления нуклеазами, опознающими сайты поли-А с последующим добавлением нуклеотида А (аденина) к З'-концу мРНК.

Известно много типов мутации. Ген может подвергнуться полной делеции. Ген может быть перестроен частичной делецией, вставками или инверсией значащих сегментов. Одноосновные изменения в кодирующих областях приводят к образованию миссенс- или нонсенс-кодонов, что в свою очередь вызывает подмену аминокислоты или преждевременную терминацию цепочки. Мутации инициатора и терминатора также могут вызывать заболевания. Кроме того, мутации могут приводить к аномальностям сплайсинга мРНК, обычно

Рис. 58-7. Мутация сплайсинга в гене Й-глобина (экзоны пронумерованы, интроны заштрихованы).

Мутация в первом нуклеотиде второго интрона приводит к образованию двух аномальных продуктов мРНК (справа).

изменением сохраняемых последовательностей вблизи границ интрон — экзон. Эти аномальности сплайсинга обычно приводят к образованию мРНК, не спо-собной производить функциональный продукт (рис. 58-7). Мутации могут наблюдаться и в управляющих областях, и в сегментах поли-А. Кроме того, болезнетворные мутации способны происходить и в тех частях генома, которые не кодируют белок, хотя таких примеров немного. Разнообразие мутаций означает, что задача обнаружения мутантных генов на уровне ДНК может оказаться весьма сложной.

Клиническое приложение молекулярной диагностики

Дефекты генов глобина. Наиболее обширный опыт молекулярного анализа заболеваний накоплен в области изучения аномальностей цепи глобина; понимание природы функционирования других генов в значительной мере определилось результатами исследований именно этих мутаций. При значительной делеции основных участков кластера глобинной цепи для демонстрации наличия гомозиготных дефектов можно использовать Саузерн-блоттинг. Деления гена является обшей причиной а-талассемии, и пренатальная диагностика этих дефектов выполняется непосредственно с использованием зонда из кДИК либо из геномной ДНК. Идентификация гетерозиготных делений требует либо тщательного количественного анализа, либо демонстрации аномально соединенных фрагментов из мутантного сайта. Обширные делеции редко бывают причиной мутаций в кластере р-глобина, но они характерны при наследственной персистен- ции фетального гемоглобина (рис. 58-8) и при некоторых формах А-р-талассемии.

Саузерн-блоттинг, напротив, неэффекти- ' вен для обнаружения большинства одно- л- основных изменений генома. Первый метод

‘ молекулярной диагностики серповидно-клеточ

ной анемии включал в себя ранее упомянутое ПДРФ-фланкирование З'-конца гена р-глобина. Этот тип анализа оказался продуктивным в случае лишь нескольких семей, поскольку зачастую невозможно надежно определить фазу (см. выше и ниже в подразделе «Аутосомно-рецессивные нарушения»). Одна из альтернативных процедур, разработанных для прямой демонстрации серповидно-клеточной мутации, заключается в модификации Саузерн-блоттинга, при кото' рой в качестве зонда используется синтети

ческий 19-основный олигонуклеотид, образующий превосходящую пару либо с р5., либо с р -последовательностям и (рис. 58-9). Оли- гонуклеотидный метод может оказаться эффективным также и в других случаях.

// 20,8 )'/ . 1 Рис. 58-8. Пример анализа генов глобина

ф X человека блоттинг-методом по Саузерну.

__ * а — ДНК, выделенные у нормального индивида

—// и у лиц с гомозиготной наследственной персис-

тенцией фетального гемоглобина (НПФГ) или

с гомозиготной (1-талассемией. ДНК расщеплена ферментом ЕсоЫ. Смешанный ДНК-зонд изготовлен обратной транскрипцией мРНК ретикуло- —5,5-и-3.7И цитного глобина, б — стрелками показаны те

+ + сайты областей а- и р-глобина, которые перере

заются ЕсоК!; цифрами указана длина фрагментов ДНК (в килооснованиях) (по V. Ж Кап, // А. М. Богу. • Ргос. N1. Асаё. 8с1., И8Л, 1978,

75. 5631).

Рис. 58-9. Саузерн-блоттинг с использованием олигонуклеотидных зондов для диагностики серповидно-клеточной анемии.

Использованы зоилы из 19 оснований: Н|Я9А' для нормальной поглсловательности и Нр195 — для гена серповидно-клеточной анемии. Генотипы индивидуумов указаны над каждой линией; ДНК расщеплена рестриктазой. |-фй1 обозначает клонированную ДНК гена нормального глобина. Темные пятна в верхней части рисунка — результат неспецифической гибридизации (по В. ^ Соппег е! а1. • - Ргос. па1. АсаИ. 3с1., 115А. 1983. 80, 278).

когда значительная часть заболеваний в популяции вызывается конкретной мутацией, однако ему присущи два недостатка: во-первых, большинство генетических болезней на молекулярном уровне гетерогенны и для каждой мутации нужен специфический нуклеотид; во-вторых, широкому применению метода пре-пятствует его техническая сложность. _

Есть другой метод прямого обнаружения серповидно-клеточной мутации. обходящий эти технические трудности. Часть нуклеотидной последовательности н (V -гене - это 5'-ЦЦТГАГТ-3', а соответствующая последовательность в серповидном гене- ¦ 5'-ЦЦТПТГ-3'. Замена ГАГ на ГТГ приводит к производству валина вместо глутаминовой кислоты. Рестриктаза Мз1 II разрезает последовательность 5'-ЦЦТМАГГ-3' (Ы любое основание) и, следовательно, разрежет в этом сайте последовательность р\ но.не рз (рис. 58-10а). Расцепление^ геномной ДНК ферментом Мз! II приводит к образованию фрагментов длиной 1,15 ко при нормальном гене и длиной 1,35 ко при рЛгене. Саузерн-блоттинг с использованием Мз! II и подходящим фрагментом ^-глобина в качестве ДНК-зонда позволяет идентифицировать генотипы А5, АА и 55 (рис. 58-106). Этот метод можно рекомендовать для пренатальной диагностики серповидно-клеточной анемии, но он неприменим для диагностики большинства других болезней. Действительно, для мутации не свойственно быть болезнетворной и одновременно достаточно распространенной, чтобы вызывать ПДРФ.

Молекулярная гетерогенность при (3-талассемии иллюстрирует объем задач, возникающих при применении анализа ДНК для генетической диагностики. Для аллелей р-талассемии характерны небольшие изменения ДНК. и в первую очередь одноосновные, вызывающие преждевременную терминацию и аберрации сплайсинга. Талассемия вызывается также мутациями регуляторных областей, расположенных выше 5', и мутациями поли-А сигналов. В целом для гена р-глобина известно 17 различных мутаций сплайсинга, 10 разных сдвиговых, или нонсенс-мутаций, и 6 различных мутаций транскрипции (рис. 58-11). Один из методов генетической диагностики р-талассемии основан на ПДРФ-анализе Р-глобинного кластера. Такие вариации можно сгруппировать в гаплотип для каждой хромосомы (рис. 58-12). Предполагая, что анализ ганлотипа окажется информативным, можно поставить пренатальный диагноз в тех случаях, если в семье уже был пораженный ребенок. В общем же, всякая новая мутация д5.6.7

IV II

• С2 П ¦ГиТИВ

н

Мм И-фрагмент

Д*1-

т-

1.15

I 11910 5

А

1

Рис. 58-11. Локализация 30 мутаций, вызывающих ^-талассемию.

Белый треугольник — мутации со сдвигом рамки; белый ромб — мутации сплайсинга РНК, заштрихованный круг — транскрипционные, белый круг — мутации расщепления РНК (из 5. Е. Ап1опагак1з е! а1. — Нит. Сепе!., .1985, 69, 1).

ассоциирована с конкретным гаплотипом и имеет определенное географическое распределение. В изолированных популяциях при помощи гематологического анализа можно выявить гетерозигот, а анализом гаплотипа идентифицировать носителей и предполагаемую генетическую фазу с целью последующего скрининга гетерозигот и предотвращения талассемии. Такой анализ значительно осложняется при смешении различных талассемических мутаций в результате движения населения. Например, для греческой и итальянской популяций в Северной Америке пренатальная диагностика затруднена, если только у данной пары уже не было пораженного ребенка, что позволяет установить фазу. Прямая демонстрация мутантных генов с использованием олигонуклеотидных зондов, диагностическая обработка ферментами рестрикции и некоторые другие -

Рис. 58-12. КРЬР-гапло- гипы в кластере (5-гло- Окна.

Длины рестрикцнонных фрагментов указаны стрелками. Представлены только три из многих возможных ганлотипов: ( + ) — рас-щепление ферментом рест- рикации; (•• ) — отсутствие рестрикции (из 8. И. Огкш е1 а1. — ЙаШге. 1982, 296. 627). '

Су Ау

п

Нй 111 ™ Н1пс I

+ + +

дителей. Для семьи 2 анализ информативен лишь в отношении отца. В семье 3 оба родителя гетерозиготны по ПДРФ, но адекватно определить фазу нельзя, и анализ информативен лишь частично. Для семьи 4 анализ неинформативен, поскольку оба родителя гомозиготны в ПДрФ-сайте. Для семьи 5 полна» информация может быть получена посредством двух ПДРФ. поскольку один анализ информативен в отношении отца, ..а другой - в отношении матери-. Поскольку потенциально информативны более одного ПДРФ, то и у большинства семей анализ полностью информативен, и в большинстве семей, уже имеющих пораженного ребенка, можно поставить пренатальный диагноз. В этих семьях анализ ДНК может также выявить и гетерозиготных родственников, таких как дяди, тети, сестры, братья.

При дефиците <ц-антитрипсина точный генотипический диагноз и выявление гетерозиготности могут быть выполнены постнаталыю с помощью электрофореза белков. В большинстве случаев это заболевание вызывается несколь кими мутациями, в первую очередь 2-аллелем (одноосновное изменение с подменой аминокислоты). Пренатальная диагностика может быть осуществлена с помощью олигонуклеотидных зондов, позволяющих различить, что передал каждый из родителей плоду 2-аллель или нормальный. Кроме того, в 5'-флан- кирующей области гена «1-антитрипеина имеет место неравновесность сцепления ПДРФ, и наличие специфического гаплотипа ПДРФ в этой зоне может служить диагностическим индикатором наличия 2-аллеля. Степень этой неравновесное™ сцепления необычайно высока. Реальная осуществимость массовой индикации специфических аллелей Ы-антитрипсина может позволить предложить пренатальную диагностику всем парам, в которых оба супруга имеют М2-генотип, даже если у них нет пораженных детей.

При аутосомно-рецессивных нарушениях диагностика с использованием сцепленных ДНК зондов широкого применения не имеет, но идентификация ДНк-маркеров, близких к гену кистозного фиброза, должна изменить эту ситуацию. Онкоген те! и случайный ДНК-маркер тесно (около 1 сМ) сцеплены с геном кистозного фиброза на хромосоме 7. Эти ДНК-маркеры обеспечивают возможность пренатальной диагностики и выявления гетерозиготности в семьях с кистозным фиброзом. Принципы те же самые, что и для фенилкетонурии (см. рис. 58-13), за' исключением того обстоятельства, что между ДНК-марке- ром и геном кистозного фиброза могут происходить кроссинговеры. При попытках пренатальной диагностики в семьях, уже имеющих пораженного ребенка, следует учитывать возможность четырех кроссинговеров: двух у первого пораженного ребенка, используемых для определения фазы родителей, и двух у плода. Если ДНК-маркер находится на расстоянии I сМ от болезнетворного гена, то вероятность ошибочного диагноза составляет почти 4 %. Таким образом, сцепленный диагноз этого типа требует ПДРФ-маркеров, близких к мутантному гену, Такие ДНК-маркеры позволяют выявить гетерозиготность в пораженных семьях, но не в популяции вообще.

Одна редкая рецессивная форма дефицита гормона роста вызывается гомозиготной делецией гена гормона роста. Этот дефект является показательным примером эффективности молекулярного анализа. Во-первых, ДНК-анализ может установить этиологию задержки роста у больного ребенка. Во-вторых, он имеет прогностическую ценность, поскольку у таких детей весьма вероятно вырабатываются антитела на экзогенные гормоны роста и они могут оказаться резистентными к гормональной терапии. - В-третьих, анализ идентифицирует это состояние как рецессивный дефект с высоким риском рецидива. В-четвертых, ДНК-анализ обеспечивает возможность пренатальной диагностики в таких семьях, он эффективен также для пренатальной диагностики рецессивных дефектов типа дефицита карбамилфосфнтсинтетазы, при которых активность фермента не экспрессируется в культивированных амниотических клетках.

Аутосомно-доминантные нарушения. Некоторые гены, ответственные за аутосомно-доминантные нарушения, удалось клонировать, примером чему служат рецептор низкоплотного липопротеина (НПЛ) и антитромбин III. Для рецептора НПЛ характерна генетическая гетерогенность: большинство случаев семейной гиперхолестсринемии обязано своим происхождением унаследованным мутантным аллелям, а не новым мутациям. Для рецептора НПЛ идентифицирован по крайней мере один ПДРФ с использованием

Рй,с 58-14. Гипотетические семьи, страдающие хореей Гентингтона.

А, В и С — гаплотипы ПДРФ, обнаруживаемые сцепленными ДНК-зондами. Черные круг и квадрат — пораженные члены семьи; Р - беременность (см текст).

генного зонда, так что в некоторых случаях может появиться возможность для пресимптоматической диагностики.

Идентифицированы сцепленные ДНК-маркеры для хореи Гентингтона и гюликистоза почки взрослых. Как было установлено в 1985 г., ближайшие ДНК-маркеры находятся на расстоянии от 2 до 6 сМ от болезнетворного локуса. Хотя эти маркеры служат ценным исследовательским инструментом, их клиническое применение осложнено высокой вероятностью кроссинговеров. Необходима идентификация более -близких маркеров или самих болезнетворных генов. При хорее Гентингтона пресимптоматическая диагностика обычно нежелательна, поскольку она может привести к излишней психологической нагрузке на больных, однако возможность как пресимптоматического, так и пре- матального определения диагноза существует. На рис. 58-14 приведены гипотетические примеры семей с хореей Гентингтона и гаплотипные анализы, основанные на ПДРФ. В этих иллюстрациях предполагается, что ДНК-маркер находится на расстоянии 3 сМ от болезнетворного гена и что вероятность кроссинговера при мейозе равна 3 % как для мужчин, так и для женщин. Для семьи 1 анализ информативен, и болезнетворный аллель находится в фазе с гаплотипом В. Можно предсказать с доверительностью примерно 97 %, что беременная женщина унаследовала хорею Гентингтона, а пренатальный диагноз выполняется примерно с 94 % уверенностью. Многие члены семьи 2 умерли, и пресимптоматическая диагностика для беременной женщины невозможна, но можно предложить одну из форм пренатальной диагностики. Пели плод наследует через мать дедовский гаплотип В, то риск заболевания велик, напротив, если плод наследует через мать бабушкин гаплотип А, то риск заболевания мал. Далее, если для этой пары все беременности с гаплотипами плодов ВВ или ВС были бы прерваны, а с гаплотипами АВ или АС продолжены, то половина всех плодов была бы абортирована, но зато риск передачи хореи Гентингтона был бы заведомо . незначителен даже при неизвестной степени риска для матери. При использовании такого подхода абортированные плоды, весьма вероятно, были бы поражены хореей Гентингтона в половине тех семей, в которых поражен родитель, но были бы не поражены в половине семей с непораженным данным родителем. Ввиду ранней смерти пораженных индивидов ситуация с семьей 2 может оказаться типичной. При поликистозе почки взрослых ситуация аналогична, но отличается тем, что пресимптоматическая диагностика с помощью ультразвукового исследования почек оказывается достаточно точной. С локусом поликистоза почки взрослых тесно сцеплен высокополиморфный маркер, появляющийся в результате вариации длины в тандеме повторных последовательностей (рис. 58-15). Наличие сцепленных зондов обеспечивает возможность пренатальной диагностики этой болезни, однако вопрос о допустимости пренатального тестирования в пораженных семьях пока не решен. В заболеваниях, наследуемых по аутосоммо-доминантному типу, можно усмотреть некоторые основные особенности. Например, при заболеваниях типа дефекта рецептора НПЛ, для которых характерна высокая молекулярная гетерогенность, должен оказаться эффективным гаплотипный анализ с исполь- Рис. 58-15. Саузерн-блотти/нг семьи, пораженной поликис/го- зом почек взрослых. ,

Аллели С, й. С и Н обнаружива-ются сцепленным высокополимЬрф- ным зондом. Обозначения над.каж- до™" линией относятся к поэиции в родословной; каждый индивидуум с аллелем С страдает поли- кистозом (из 5. Т. Реейеге е1 а1. — Ыа1иге, 1985, 317, 542).

вд 24 ¦

зованием ПДРФ. В таких случаях, как хорея Гентингтона, при которой большинство случаев заболевания у потомков обязано своим происхождением одной или нескольким мутациям у предков (т. е. молекулярная гетерогенность невелика или отсутствует), большую важность приобретает клонирование болезнетворного гена и идентификация молекулярного дефекта. Прямая идентификация мутации дает возможность осуществлять пресимптоматическую и пренатальную диагностику во всех подобных случаях. Можно ожидать, что при болезнях типа ахондропластической карликовости, вызываемых новыми мутациями, анализ ДНК будет иметь ограниченную ценность. Поскольку пред-сказать появление новой мутации невозможно, то пренатальная диагностика, новых мутаций потребовала бы тестирования всех молекулярных дефектов и должна была бы проводиться при всех беременностях, что совершенно нереально. Таким образом, клонирование гена ахондроплазии с точки зрения практической нренаталыюй диагностики бесполезно. Далее, диагностика посредством ДНК-анализа будет, вероятно, весьма осложнена большой молекулярной гетерогенностью при таких болезнях, как синдром Марфана, туберозный склероз и некоторых других, при которых в каждой семье поражается лишь незначительное число ее членов. Особенно сложна молекулярная диагностика при болезнях, вызываемых генами коллагена, ввиду больших размеров и сложности этих генов и высокой степени молекулярной гетерогенности (см. гл. 319). Некоторые мутации в гене коллагена вызывают аутосомно-доминантмые заболевания, а другие мутации в том же самом гене приводят к образованию аутосомно-рецессивных фенотипов.

Х-сцепленные нарушения. Те же принципы с некоторыми модификациями приложимы и к Х-сцеплекным заболеваниям, для которых получены клонированные гены, например, для дефицита фактора VIII (гемофилия А) и дефицита фактора IX (гемофилия В). Деления, значительная перестройка гена или иногда мутация в рестрикционном сайте в некоторых случаях дают возможность прямого детектирования мутации. В других случаях возникает необходимость воспользоваться сцепленным анализом- с использованием ПДРФ и клонированного гена в качестве зонда. Поскольку мужчина имеет единственную Х-хромосому, то для них анализ определяет фазу сцепления между ПДРФ с болезнетворным геном даже тогда, когда отец не передает заболевание детям. На рис. 58-16 представлены гипотетические семьи с гемофилией А, в качестве зонда используется клонированный ген фактора VIII. Для семьи 1 анализ информативен, а фаза (между геном гемофилии и гапло- типом В) может быть определена из анализа пораженного внука непораженной бабушки. Семья 2 иллюстрирует преимущества прямого обнаружения мутации по сравнению с анализом ПДРФ в тех случаях, когда неясно, вызвано ли заболевание унаследованной или новой мутацией. Определить, является ли беременная гетерозиготом, можно только прямым, но не ПДРФ-анализом. Если прямое детектирование невозможно, то тест на гетерозиготность этой женщины зависит от анализа активности фактора VIII и наличия антигена. Пренатальная диагностика для семьи 2 должна опираться на утверждение: если мать является носителем, то только плоды мужского пола с гаплотипом В входят Рис. 58-16. Семьи, страдающие гемофилией А.

Гаплотипы А и В основаны на ПДРФ с использованием гена фактора VIII в качестве зонда. Черные квадраты — пораженные мужчины, кружок с точкой — женщина — облигатный носитель; Р — беременность (см, текст).

Рис. 58-17. Факторы, используемые для определения фазы сцепления (на примере Х-сцепления). А и В гаплотипы ПДРФ, обнаруживаемые с использованием ДНК-маркера, расположенного в 10 см от бо лезнетворного локуса; Р беременность (см. текст). ©-гО АВ А

(В) (В) АВ 8 ё х

, * Р ОгО

АВ А

О-гО

АВ В От-О

АВ А

ОтО

АВ В

6 1 ^

3 В В 0~г0

тЪт<з

&

, А Р р,

/ Ав|а 1 Л

2 АР &Т0

АВ А 3 в в"

в группу риска по данному заболеванию, а если мать носителем не является, то плоды мужского пола в группу риска не входят. В семье 3 два брата, один здоровый, другой пораженный, унаследовали один и тот же гаплотип. Поскольку вероятность кроссинговера в пределах гена фактора VIII невелика, то ребенок, по-видимому, поражен новой мутацией, мать носителем не является, а риск еще одной новой мутации при этой беременности пренебрежимо мал. Определение гетерозиготности с помощью гормонального анализа при Х-сцепленных •заболеваниях осложняется случайными инактивациями Х-хромосом, поэтому там, где это возможно, для определения гетерозиготности следует предпочесть ДНК-анализ.

Некоторые трудности, возникающие при определении фазы сцепления методом сцепленного анализа, иллюстрируются гипотетическими Х-сцепленными дефектами, изображенными на рис. 58-17. В каждом примере беременная женщина является обязательным носителем дефекта, а ДНК-маркер находится в 10 сМ от болезнетворного гена. Для семьи 1 вероятность того, что гаплотип А существует совместно с болезнетворным геном в генотипе матери, составляет 90 %. Это утверждение основано на исследовании внука; точность пренатальной диагностики для мужских плодов составляет примерно 81 % из-за комбинированной неопределенности" фазы и вероятности кроссинговера для плода. Семья 2 идентична семье 1, за исключением того, что имеющаяся информация о гаплотипе относится к деду и указывает на то, что болезнетворный ген находится в фазе с гаплотипом у матери. Поражение ребенка в семье 2 должно быть результатом кроссинговера, а точность пренатальной диагностики для мужских плодов составляет примерно 90 %. Обратите внимание на прогноз, что плоды с гаплотипом А будут поражены в семье 1 и не поражены в семье 2. Для семьи 3 вероятность того, что болезнетворный аллель сцеплен с гапло-

- Рис. 58-18. Эффект флан-кирующих сцепленных ге-нетических маркеров при Х-сцепленном заболевании (см. текст).

ПДРФ ПДРФ

^ 10 СМ 60Л|?НЬ ЮСМ #2

ОДИН МАРКЕР ИНФОРМАТИВЕН '

-100 % СЕМЕЙ, ДОСТОВЕРНОСТЬ 90 %

ДВА МАРКЕРА ИНФОРМАТИВНЫ

81 % СЕМЕЙ, ДОСТОВЕРНОСТЬ 99 %

19 % СЕМЕЙ. ДИАГНОЗА НЕТ типом В, составляет 99 %, поскольку два пораженных сына проявляют одну и ту же фазу (обратите внимание на разницу с семьей 1, в которой только один пораженный ребенок). Точность пренатальной диагностики у плодов мужского папа составит примерно 90 %. Аналогичные принципы используются и для определения фазы с аутосомными маркерами.

Преимущество двух фланкирующих сцепленных маркеров иллюстрируются на рис. 58-18 на примере Х-сцепленной наследственности. Р-сли предположить, что каждый маркер отстоит от болезнетворного локуса на 10 сМ, пренатальный диагноз будет иметь точность 90 % в том случае, если только один маркер информативен. Если информативны оба маркера, то вероятность кроссинговера между двумя ДНК-маркерами составит 20%, а вероятность двойного кроссин-

Та блица 58-2. Роль молекулярного анализа при диагностике генетической болезни Болезнь Детекти ПДРФс ПДРФ со Примечания рование 1 генным сцеплен мутации' зондом ным мар-кером Серповидно-клеточная + + + + Анализ с Мз1 II анемия (5-Талассемия + + + + Очень гетерогенна а-Талассемия + + + + Много делений Гемофилия А + + + + Гемофилия В + + + + Фенилкетонурия + ++ + аьАнтитрипсин 22 + + + + Дефицит антитромби + + + Важны биологиче на III ские тесты Семейная гиперхолесте + + + То же . ринемия Дефицит гормона роста + Редкая форма Синдром Леша — Нихена + + + + Определение гетеро-зиготности Ретинобластома + + + Наследуемая форма Хорея Гентингтона + + + Задержка по этиче-ским соображениям Миотоническая дистро + + фия Поликистоз почки взрос +++ лых Дефицит орнитинтранс- + +++' Пренаталыю и на карбамилазь) гетерозиготность Дефицит карбамилфос- + +++ фатсинтетазы Х-сцепленная пигмент ++ + ная ретинопатия Ломкий Х-синдром +++ Кистозный фиброз + + +

" Символ «плюс» отражает относительную важность иоялола на конец 1985 г. Дополнительные заболевания, новые клоны и методы должны быстро изменить вид этой таблицы.

говора-- 1 %. Таким образом, примерно для 'Д. всех семей анализ будет неопределенным, но зато и тех случаях, когда фаза сцепления между двумя фланкирующими маркерами сохраняется, точность диагноза составит 99 %.

Руководство к клиническому применению. Некоторые болезни, при диагностике которых анализ ДНК'достаточно информативен, перечислены в табл. 58-2. Семьям, члены которых страдают заболеваниями, следует предложить молекулярные исследования как часть предрспродуктивной оценки и консультации. Кровь для исследований рекомендуется брать у лиц, пораженных хореей Ген- тингтопа, мышечной дистрофией Дюшснна. кистозным фиброзом и поликистозом почки. Отсутствие ДНК от пораженных индивидов или от старших членов семьи может сделать невозможным генетическое диагностическое тестирование млад- 1ГИХ членов семьи. '

В заключение можно сказать, что ПДРФ-анализ со сцепленным маркером достаточно эффективен, но цел»ччх>бразнео проводить ПДРФ-анализ с болезнетворным геном в качестве зонда; прямое детектирование мутации оптимально, но более сложно, так как требует кпк изоляции самого гена, так и метода идентификации каждой мутации. Приведенные примеры подчеркивают также сложность идентификации новых мутаций, определения гетерозиготного статуса, установления фазы сцепления и установления информативности анализа по сцеплению. ,

Молекулярная цитогенетика. Метод рекомбинантной ДНК перекидывает мост между одногенными дефектами и цитогенетикой (см. гл. 60). Генетические нарушения простираются от одногенных изменений до приобретения или утраты целой хромосомы. Например, у некоторых больных с мышечной дистрофией Дюшенна в большей степени выражены цитогенетические аномалии, у других наблюдаются значительные делении ДНК при очевидно нормальных результатах цитогенетических анализов, а у третьих, вероятно, будут иметь место одноосновные изменения.

Патогенетические аномалии можно изучать, используя либо Саузерн-блот- тинг, либо гибридизацию 1п зИи. Саузерн-блоттинг можно использовать для количественного анализа в отношении любых уникальных сегментов ДНК, как что показано на рис. 58-19. Для любой хромосомной делении, дупликации или транслокации можно определить, попадает ли данный ДНК-зонл на аномальную область. В самом деле, ДНК-анализ обнаруживает гетерозиготные делении, которые слишком малы для индикации стандартными методами цито- генстики. Например, около половины пациентов с синдромом Прадера--Вилли имеют делении или другие аномалии в проксимальной части длинного плеча хромосомы 15, причем необходимо отметить, что результаты цитологического анализа у части из них не выявили нарушений. В то время как при помощи молекулярных исследований таких пациентов возможно обнаружить делении, которые слишком малы для микроскопической идентификации. В исследовательских целях Саузерн-блоттинг можно применить для анализа гибридов соматических клеток, которые содержат транслоцированные или перестроенные хромосомы, отсепарированные от их нормальных гомологов. С помощью этих методов можно определить положение любого ДНК-маркера относительно любого цитогенетическрго нарушения.

В методе гибридизации т зИи радиоактивный ДНК-зонд используется для прямой ренатурации хромосомной ДНК в фиксированных тканевых препаратах. Такую ренатурацию можно обнаружить при помощи радиоавтографии в тех областях хромосомы, которые содержат уникальные последовательности комплементарной ДНК. В клинических целях этот метод можно использовать для определения наличия или отсутствия в пределах аномальной хромосомы некоторого сегмента ДНК и, таким образом, определить, не подвергся ли этот сегмент делении, или найти положение этого сегмента относительно точки балансированной транслокации. ДНК-анализ применялся также для детектирования Х-хромосомных специфических последовательностей у мужчин с 4И XX генотипом и у истинных гермафродитов с тем же генотипом (см. гл. 3.33).

Молекулярная онкология. Известно по крайней мере три типа молекулярных изменений, ассоциированных с опухолями человека, каждое из которых меняет экспрессию онкогенов (см. гл. 59). Сюда входят одноосновные изменения кодирующей области нормальных онкогенов, амплификация числа копий и хромосом-

а

Рис. 58-19. Пример количественного анализа с использованием цитогенетически аномальных клеточных линий.

Саузерн-блоттинг выполнен с кДНК-зондом, перекрестно реагирующим с последовательностями геномной ДНК II различных хромосом, включая X и У. Хромосомный состав указан над каждой линией (а). Ясно видна разница для ДНК-сайтов хромосом 2, Хр, Хя и У; в то же время плотности для сайта хромосомы 9 совпадают (б) (из Т. 5. 5п е! аI. — Ат. ^ Нит, Сепе!., 1984, 36, 954). '

ные транелокации с точкой разрыва в онкогене или рядом с ним. Каждое из этих изменений может быть обнаружено посредством Саузерн-блоттинга. Анализ опухолевой ДНК на изменение последовательностей в онкогене, на амплификацию онкогена и на относительные транслокации обеспечивает в конечном итоге получение диагностической и тера/ц?втической информации о данном больном.

Другие опухоли ассоциированы с утратой функции обоих аллелей в специфических сайтах генома, например, тех, которые в норме подавляют образовав ние опухоли. Если один нормальный аллель такого гена инактивирован, то утрата или деформация сегмента в этой области другой хромосомы будет сопровождаться утратой супрессивной функции. Впервые это было показано на примере ассоциации ретинобластомы • с определенной областью хромосомы 13д, а затем и ассоциации опухоли Вильмса с областью хромосомы 11р. Утрата второго функционального гена часто запускает механизм, воздействующий на примыкающие участки ДНК (например, цитогенетическая деления). Сравнивая опухолевую и неопухолевую ДНК одного и того же пациента, можно вывести заключение о том, имела ли место утрата гетерозиготпости вблизи локуса-супрессора. В случае доминантно наследуемой ретинобластомы генетическая консультация может опираться на аиализ по сцеплению с использованием ДНК-маркеров; для определения фазы сцепления можно использовать анализ опухоли на гетерозиготность, при этом сохранившийся аллель маркирует дефектную хромосому, а утраченный • • конститутивно нормальную. ,

Диагностическая вирусология и микробиология. Всякий микроорганизм имеет ДНК- или РНК-геном, который можно обнаружить методом гибридизации нуклеиновых кислот. Как уже обсуждалось выше, методы гибридизации . чувствительны и специфичны, и их вполне можно использовать для определения присутствия последовательностей нуклеиновых кислот микроорганизмов в биологическом материале, взятом у человека (например, кал, моча, кровь, биопсия тканей). Такие методы могут оказаться особенно эффективными при диагностике цитомегаловируса, ротовируса, вируса Эпстайна — Барра и др.

Другие сферы приложения молекулярного анализа. Фрагменты ДНК, которые гибридизируются с многочисленными, повторяющимися, высокополиморфными последовательностями генома, можно использовать для определения полиморфных различий между двумя индивидами в рамках единственного анализа и даже в том случае, когда варианты фрагментов нелегко приписать к конкретным хромосомным сайтам. Анализ такого типа применяется, например, для быстрого определения неидентичности двух индивидов. Например, методом Саузерн- блоттинга можно различить неидентичных близнецов или клетки донора и хозяина после пересадки костного мозга. Такие зонды имеют ' существенные преимущества перед обычными генетическими маркерами и могут оказаться эффективными при определении отцовства и в практике судебной экспертизы для идентификации индивида по образцам спермы, крови и корней волос. Возможна также типизация тканей по НЬЛ-локусам с использованием ПДРФ; такие анализы ДНК могут дополнить или заменить иммунологические методы.

Клинические продукты рекомбинантной ДНК. Клонированные последова-тельности ДНК можно использовать для синтеза белков и пептидов. Основные преимущества этого метода заключаются в возможности производства неогра-ниченного количества чистого неконтаминиро'ванного вещества. Продуцентами этих веществ могут служить бактерии или дрожжи.

Правильный сплайсинг эукариотической мРНК в бактериях невозможен, поэтому кодирующие области обычно представлены клонами кДНК или последовательностями синтетической ДНК. Кодирующая область должна быть сцеплена с теми сегментами бактериальной ДНК, которые управляют транскрипцией и инициируют трансляцию. Основная трудность состоит в нехватке эукариотических механизмов посттрансляционного процессинга. Почти все бактериальные и эукариотические белки подвергаются протеолитическому расщеплению в аминотерминаторах с удалением инициатора метионина, при этом расщепления могут быть многочисленными, как это имеет место при производстве различных гормонов гена проопиомеланокортина. Другие формы посттрансляционной модификации включают в себя добавление углеводов, фосфорилирование, окисление, формирование дисульфидных мостиков и витамин К-зависимое кар- боксилирование. Неправильно или не полностью процессированные белки не могут функционировать нормально, но могут обладать антигенными свойствами.

. Все эти трудности были преодолены при синтезе человеческого инсулина. Обычно образование зрелого инсулина состоит в формировании трех дисульфидных мостиков в одиночной полипептидной цепи с последующим протеолитиче- ским расщеплением для.удаления С-пептида и сшиванием а- и Р-цепей. Одна стратегия состояла в раздельном продуцировании а- и р-цепей последовательностями синтетической ДНК. Поскольку цепь зрелого инсулина не содержит аминокислот метионина и триптофана, то метионин-инициатор оказалось возможным удалить химически. Затем цепи сшивались, а дисульфидные мостики формировались т УКГО. - >

При производстве гормона роста бактериальная пеитидаза не удаляет из белка амино-терминальный метионин, что. приводит к продуцированию гормона роста с излишним метиониновым остатком в амино-терминале. Хотя метиони- лированный гормон роста активен в организме человека, иммунологические соображения препятствуют его широкому применению. Гормон роста может служить примером чрезвычайной дефицитности натурального продукта, а случаи болезни Крейтцфельда — Якоба среди пациентов, получивших гормон роста, выделенный из тканей человека, подчеркивают потенциальные преимущества продукта рекомбинантной ДНК (см. гл. 322). Производство продукции рекомбинантной ДНК в метках культуры ткани позволило бы обойти большинство неприятностей, связанных с посттрансляционным процессингом, но при этом может возрасти вероятность контаминации человеческими патогенами. Фактор VIII и фактор IX, полученные методом рекомбинантной ДНК в клетках культуры тканей, проявляют коагулирующую активность.

Некоторые белки, производимые технологией рекомбинантпой ДНК, более других подходят дли клинического'использования. Те белки, которые присутствуют в кровяном русле, наиболее пригодны для наметающей терапии. Инсулин, гормон роста, факторы свертывания крови, ш-антитрипсин, антитромбин III и другие белки плазмы крови -- все что примеры продуктов, пригодных для парентеральной замещающей терапии. Кроме того, фармакологическое применение могут иметь продукты, действующие в сосудистой системе и внеклеточном пространстве. Например, при остром инфаркте миокарда многообещающим выглядит тромболитическое лечение активатором плазминогена тканевого типа. Аналогично, предварительную опенку и качестве средств лечения злокачественных заболеваний проходят интерфероны (и-.-И- и у-), фактор некроза опухоли- и интерлейкин-2. Менее явна ценность продуктов рекомбинантной ДНК. которые должны функционировать внутриклеточно. Рекомбинантные гормоны для замещающей терапии получить можно, но остается проблема прицельной внутриклеточной тка«еепецнфичной доставки. Например, можно производить в больших количествах и-галактозидазу Л и глкжоцереброзидазу для лечения соответственно болезни Фабри и болезни Гоше, но нет достоверной системы до- станки этих гормонов. Белки, для которых нет механизма эндоцнтоза. и белки, функционирующие в центральной нервной системе, вряд ли могут рассматри-ваться как подходящие кандидаты для заметающей терапии. Хотя большинство продуктов рекомбинантной ДНК. проходящих в настоящее время испытания, не доведены полностью до зрелого поеттрансляционного состояния, большая их часть биологически активна.

Метод рекомбинантной ДНК эффективен также при приготовлении диагностических реагентов и вакцин. Рутинным методом производства вакцин, состоящим в инактивации вирусных частиц или в выращивании ослабленных живых вирусных штаммов, присущ определенный риск. В ряде случаев имеет место неполная инактивация вируса или контаминация вмкцины другими вирусами. Кроме того, вакцина против гепатита В, приготовляемая из человеческой плазмы, может быть загрязнена белками, что вызовет аллергическую реакцию у части ..полей. Живые ослабленные вирусные штаммы склонны к изменчивости и могут вызывать заболевания у реципиентов с иммунологическим компромиссом. Про- шводство же вирусных белков с применением рекомбинантной технологии позволит получить антигены, приемлемые для вакцинации. В настоящее время имеется вакцина против ящура и проходит испытание на людях антиген гепатита В, продуцентом которого послужили дрожжи. Альтернативным подходом в производстве новых, в частности поливалентных, вакцин является введение в геном вирусов вакцинного штамма одной или более последовательностей ДНК, кодирующих антигены. Например, последовательность ДНК вируса гриппа рекомбинируется с вакциной, чтобы получить вакцину, защищающую и от гриппа, и от возможных последствий вакцинации. ' ,

Технологией рекомбинантной ДНК могут быть получены также диагно-стические реагенты. Например, можно получить антигены вирусов синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) и гепатита В для использования их в раднонммуиологических тестах при вирусной диагностике. Многие ферменты, используемые в диагностических тестах, и многие рестрнктазы и полимеразы нуклеиновых кислот, используемые в диагностике методом рекомбинантной ДНК. также получены с помощью клонированных генов этих ферментов.

Перспективы исследований

Возможности ген-замещающей терапии. Если для некоторого генетического дефекта человека идентифицирован мутантный ген и можег быть получен клонированный нормальный ген, то имеет смысл рассмотреть ряд стратегий для ген-замещающей терапии (табл. 58-3). Основное теоретическое преимущество ген-замещающей терапии перед фермент- или фактор-замешающим видом терапии заключается и том, что единственное терапевтическое воздействие может обеспечить постоянную коррекцию. Не|т заболевание вызнано простым недостатком продукта, как при большинстве ферментных дефицитов и болезней свертывания крови, то любое восстановление синтеза нормального Болезнь Степень

тяжести Альтернативное лечение и его эффект Частота встречаемости болезни Тканевая специ-, фичность Регуляция Сравнительная осущест-вимость! Гемоглобинопатии Большая Трансфузия; сред 1 на 600 в этнических Эритроциты Необходима + + ний до слабого группах Синдром Леша—Ни- Большая Слабый Редко встречаю Мозг, ?другие Не существенно + + хена щийся Лдеиозиндеаминаза и Большая - Трансплантация; Очень редко встре Костный мозг » » + + + + нуклеозидфосфори- средний до сла чающиеся лаза бого Фенилкетонурия Малая до Диета; положи 1 на 1100 - Печень, ? другие » » + + средней тельный ш -Антитрипсин Средняя Слабый 1 на 3500 Печень, ? другие >» + + + Гемофилия А и В Средняя до Замещение; слабый 1 на 10 000 мужчин ?Любой орган; + + + + бол ьшой (СПИД) фактор VI11 Болезнь лизосомаль- Большая Слабый 1 на 1500 для всех Мозг во многих » » + ного накопления типов случаях Семейная гиперхоле Большая Диета, лекарствен 1 на 500 гетерозигот Печень, ?Дру- До некоторой + + ¦ стеринемия ная терапия; гие степени важ средний но Кистозный фиброз Большая Поддерживающее; 1 на 2000 представи 5 ? Нет клона средний до сла телей белой расы бого Мышечная дистрофия Большая Слабый ¦ 1 на 10 000 мужчин ? Мышцы э Нет клона Дюшенна Хорея Гентингтона Большая Слабый 1 на 20 000 ? Мозг р Нет клона 1 Относительная осуществимость отражает попытку принять во внимание необходимость в регуляции, способдоставкн к органу, наличие /альтернативных методов лечения и отношение риск—польза.

продукта может иметь благотворные последствия; при этом обеспечение нормаль-ной тканеспепифической экспрессии и точной регуляции экспрессии гена может оказаться не столь уж абсолютно необходимым. Для других генных продуктов, таких как глобины, соответствующий уровень генной и тканеспецифической экспрессии может оказаться критическим. Если продукт мутантного гена оказывает разрушительное воздействие на организм, то элиминация дефектного гена может оказаться стиль же или даже более необходимой, чем его замещение. В этой связи усилия генной терапии прежде всего должны быть сосредоточены на пациентах с тяжелыми заболеваниями, представляющими угрозу для жизни.

Можно рассмотреть но крайней мере три тина замещений ДНК. В первом случае кДНК могла бы вводиться под контролем инородного промотора, но в этом случае продукт будет синтезироваться без правильной регуляции. При второй стратегии в геномную ДНК могли бы включаться последовательности. необходимые для правильной регуляции уровня и тканевой специфичности экспрессии. Искусственная «минигенная» структура, связывающая геномные регуляторные области с кДНК, обеспечила бы создание конструкции приемлемого размера с правильной регуляцией функции. Такие стратегии, как правило, предполагали бы наличие включений в хромосому случайных последовательностей ДНК, хотя возможна и экспрессия экстрахромосомных последовательностей. Третья стратегия могла бы основываться на использовании сайт-специ- фических рекомбинаций, которые удаляли бы мутантную область и замещали ее на нормальные последовательности ДНК. Однако этот феномен трудно реализовать в животных клетках.

Потенциальными агентами для генной терапии являются ретровирусные векторы. Такие векторы располагают механизмами хромосомной интеграции и способны производить вирусные частицы, кодирующие чужеродную нуклеиновую кислоту. Одна из современных стратегий рассматривает включение кДНК или минигенной ДНК-конструкции в плазменный вектор между двумя вирусными длинными терминальными повторами (ДТП) (рис. 58-20). Эти конструкции можно ввести в культуры клеток, которые обеспечат производство вирусных белков, необходимых для упаковки псевдовирусных частиц, содержащих интересующие нас генные последовательности. Например, у больного со специфическим дефектом можно было бы взять клетки костного мозга, заразить их по. добиымн вирусными частицами, а затем «перезаселить» костный мозг этого больного «перестроенными» клетками. Введение гена в такие ткани, как печеночная, более сложно, но и тут существуют некоторые возможности. Рис. 58-21. Стратегия для вставочного мутагенеза у мы-ши с последующим клониро-ванием поврежденного аллеля.

ДОМИНАНТНАЯ ИЛИ РЕЦЕССИВНАЯ МУТАЦИЯ У МЫШИ

¦ ФОРМИРОВАНИЕ

БИБЛИОТЕКИ

ДНК

Альтернативные стратегии могут заключаться в упаковке ДНК в липосомы, наработке вирусных векторов и использовании векторов, остающихся в экстра- хромосомном состоянии. Однако всякий раз отношение польза -риск при соматической ген-замещающей терапии должно оцениваться индивидуально. Случайные включения в геном последовательностей ДНК связаны с возможным риском карциногенеза. Опираясь на опыт использования ретровирусов, не содержащих онкогенов, можно утверждать, что риск может быть сравнительно невелик, если вирусы не репродуцируются в организме реципиента. Такой риск может быть оправдан для больных с угрожающим жизни заболеванием, особенно при отсутствии разумной терапевтической альтернативы. Возможным кандидатом для первых попыток в этой области может явиться дефицит адено- зиндеаминазы, а также и другие дефициты ферментов и факторов свертывания. В том случае, если окажется возможным обеспечить правильную регуляцию генов глобина, важными претендентами окажутся такие заболевания, как сер-повидно-клеточная анемия и талассемия, поскольку, во-первых, костный мозг доступен для манипуляций т УИГО, во-вторых, заболевания эти относительно широко распространены и, в-третьих, природа их достаточно сложна. Серьезным вызовом для исследователя являются нарушения, требующие точной регуляции генной и тканеспецифической экспрессии, что характерно для заболеваний центральной нервной системы.

Фундаментальные исследования. В настоящее время клонировано более 300 генов человека и других млекопитающих. Многие из этих генов являются частью сложных функциональных систем, природу которых мы понимаем лишь частично. Клонирована группа генов, управляющих сегментом дифференциации у дрозофилы; гомологичные последовательности имеются и у человека, и они могут обладать сходными функциями. Изучение и клонирование генов, ответственных за развитие хореи Гентингтона, поликистоза почки, кнетозного фиброза и мышечной дистрофии Дюшенна, способствуют углублению нашего понимания биологии нормальных аллелей этих генов и могут привести к разработке новых методов терапии хотя бы некоторых из этих заболеваний. ,

Метод рекомбинантной ДНК может оказаться мощным инструментом изучения нейробиологии и биологии развития. Можно создать библиотеку клонированных кДНК для специфических участков ЦНС и для специфических этапов эмбриогенеза. Другая стратегия рассматривает генерацию ' новых мутаций у мыши методом вставочного мутагенеза (рис. 58-21). Чужеродную ДНК можно в случайном порядке ввести в геном раннего эмбриона мыши либо прямой инъекцией, либо с помощью ретровирусного заражения. При этом функциональные области ДНК способны разрываться, образуя. рецессивные или доминантные фенотипы. Затем можно отобрать те фенотипы, которые представляют биологический интерес, например, связанные с аномалиями развития или неврологическими нарушениями. Вставочную чужеродную ДНК можно использовать в качестве зонда для клониропания поврежденных участков ДНК.

Таким образом можно создавать информативные мутантныо фенотипы и сразу же клонировать интересующий ген. Клонированные последовательности можно использовать для поиска последовательностей мРНК, а по ним определять сайты тканеспецифической экспрессии и временные характеристики экспрессии гена. Если данный участок кодирует белок, то по последовательностям нуклеиновых кислот можно определить структуру пептидов, которые затем можно синтезировать и использовать для наработки антител, с помощью которых можно было бы определить тканеспецифическое и клеточноспецифическое размещение этого белка. Например, метод вставочного мутагенеза был использован для идентификации летальной эмбриональной мутации в гене коллагена типа I у мыши. Перечисленные средства позволяют создавать информативные фенотипы, исследовать молекулярную основу фенотипа и делать заключения о соответствующей нормальной биологии и физиологии. ,

Наличие подробных генных карт человека значительно упрощает поиски генетических вариаций, ассоциированных с предрасположенностью к заболе-ванию. Тот факт, что многие известные болезни ассоциируются с Н1_А-локусом, может объясняться либо тем, что гены предрасположенности к заболеваниям локализуются преимущественно в этой области, либо тем, что для высоко-полиморфных маркеров проще получать данные. По мере картирования посредством ПДРФ других частей генома могут проявиться дополнительные ассоциации между заболеваниями и генетическими маркерами. Такие ассоциации будут способствовать идентификации тех генов, вариации которых предрасполагают к полигенным или многофакторным заболеваниям.

Этические соображения. В настоящее время пренатальную диагностику осуществляют при болезнях различной степени тяжести, таких как дефицит а1-антитрипсина, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия, мышечная дистрофия и семейная гиперхолестеринемия. В вопросе о допустимости искусственного прерывания беременности по поводу этих заболеваний мнения обще-ственности и отдельных лиц разделились. Развитие ген-замещающей терапии и других методов лечения неизлечимых ныне генетических заболеваний может выразиться в конечном итоге и в снижении частоты абортов. .

Возможности ген-замещающей терапии затрагивают и другие этические проблемы. Соматическая ген-замещающая терапия связана с индивидуальной оценкой соотношения «риск -польза» для каждого больного. До тех пор пока не затрагивается ДНК половых клеток, людей обычно интересует лишь один серьезный этический вопрос: наилучшим ли образом соответствует данный метод лечения интересам пациента? Опыт химиотерапии рака позволяет предполагать, что небольшой уровень ненамеренных повреждений ДНК половых клеток воспринимается как нежелательный, но оправданный риск такой терапии,' если она приносит больному существенную пользу. Можно представить, что в будущем методы сайт-специфической рекомбинации позволят замещать мутантную ДИК в половых клетках нормальным материалом. Если кто-то раз и навсегда сможет корректировать в половых клетках человека мутации, приводящие к кистозному фиброзу, хорее Гентингтона или серповидно-клеточной анемии, и если лечение будет эффективным и безопасным, то будет ли общество рассматривать такую терапию как грубое вмешательство?

Список литературы

АпОпагаШз 5. Е. е! а1. ОМА ро1утогрЫ§т апй то1еси1аг ра!Ыо1оду оГ 1Ые Ыитап д1оЫп депе с1и§1ег§. -Нит. Оепе!., 1985, 69, 1.

Веаиёе1 А. Е. ВШИодеарЫу оГ с1опей Ыитап апй о!Ыег §е1ес1ей ОМАз. — Ат. I.

Нит. Оепе!, 1985, 37, 386.

ВоШет В. е! а1. Соп§1гисИоп оГ а депеИс Цпкаде тар т тап и§тд ге§1псИоп Ггадтеп! 1епд!Ы ро1утогрЫ§т§. — Ат. I. Нит. Оепе1, 1980, 32, 314.

ОШ Р. е! а1. РогепмсаррЦсаИоп оГ БМА „Гтдегрпп1§". - Ма!иге, 1985, 318, 577. ОизеПаЕ. Е. е! а1. ОМА тагкегз Гог пгуои§ §у§1ет Й1§еа8е§. — 8с1епсе, 1984, 225, 1320.

Еа^п Я. М. е! а1. ТЬе то1еси1аг депеИсз оГ ЫеторЫИа: В1оой с1оШпд Гас1ог§ ММ апй IX. - Се11, 1985, 42, 405. '

Мопасо А. Р. с( а1. Бе(есйоп оМе1ейоп8 зрапшпд (Ье БисЬеппе ши§си1аг ёузйо- рЬу 1оси8 из1п§ а й§Ь(1у Ипкей БКЛ зедтепй - Ка(иге, 1985, .416,' 8\2. Ыектагк Р. Тезйпд юг сузйс йЪгозв. -- Ка(иге, 1985, 318. 309.

КвсИвк 8. Т. е( а1. А Ы§Ъ1у ро1ушогрЫс БКА тагкег Ипкед (о айи1( ро1усузйс кМпеу (Изеазе оп сЬготозоте 16. - Ка(иге, 1985, 317, 5-12.

№аЬоп 7. Б. е( а1. КесотЫпап! БКА. А 8Ьог( Соигзе. - 8с1епййс Атег1сап Воокз. Б18(г1Ъи(ей Ъу А. Ргеетап Со., Кеда Уогк, 1983.

ШШатх Б. А. е( а1. 1п(гойисйоп о! педа депейс та(епа1 т(о р1ипро(еп( Ьаета- (оро1ейс з(ет се11з о! (Ье тоизе. Ка(иге, 1984, 310, 476.